Gene KCNQ4 (DFNA2)

GENE KCNQ4(DFNA2)

Funzione

undefinedSottofamiglia canale del potassio voltaggio-dipendenti KQT membro4conosciuto anche come voltaggio-dipendenti canale del potassio subunità K v7.4 è una proteina che nell'uomo è codificata dal KCNQ4 gene. [1] [2] [3] La proteina codificata da questo gene forma un canale del potassio che si ritiene di svolgere un ruolo fondamentale nella regolazione dell'eccitabilità neuronale, in particolare nelle cellule sensoriali della coclea. La proteina codificata può formare un canale del potassio omomultimerico o possibilmente un canale eteromultimerico in associazione con la proteina codificata dal KCNQ3 gene. [3]

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/b/b8/Protein_KCNQ4_PDB_2ovc.png"

PBB GE KCNQ4 221083 at fs.png 

 

 

 

 

          Genomics Institute of the Novartis Research Foundation                                    

 

 

Emw - Own work. Licensed Protein KCNQ4 PDB 2ovc" by under CC BY-SA 3.0 via Wikimedia Commons –

 

Significato clinico

La corrente generata da questo canale è inibito dal recettore muscarinico M1 e attivato da retigabine, un farmaco anti-convulsivanti romanzo. Difetti in questo gene sono una causa di  sordità neurosensoriale non sindromica tipo 2 (DFNA2), una forma autosomica dominante di perdita progressiva dell'udito. Due varianti di trascrizione che codificano diverse isoforme sono state trovate per questo gene. [3]


Questo gene si esprime principalmente nelle cellule ciliate esterne, codificando per un canale per il potassio. voltaggio-dipendente. La sordità, trasmessa con modalità dominante (DFNA2) è lentamente progressiva (peggioramento di 1 dB/anno), inizialmente interessa le frequenze acute, ed è spesso accompagnata da acufeni L’età d’esordio è variabile, fra i e 30 anni

Negli organi vestibolari, KCNQ4 è limitata alle cellule cigliate di tipo I e le afferenti calice-come terminazioni nervose sovrapposti che rivestono queste cellule sensoriali. KCNQ4 si esprime anche nei neuroni di molti, ma non tutti, i nuclei del percorso uditivo centrale. È presente, ad esempio, nei nuclei cocleari, i nuclei del lemnisco laterale e collicolo inferiore.  La proteina codificata dal gene KCNQ4, è un canale specializzato al passaggio di potassio, ha 6 domini transmembrana e un’ansa P tra i domini transmembrana SS e 56. Nei canali potassio, che sono tetrameri costituiti da subunità identiche o omologhe, 4 di queste anse P, altamente conservate, si combinano per formare il poro selettivo per il potassio. Come per altri canali KCNQ, il KCNQ4 ha una porzione C terminale molto lunga che costituisce circa metà della proteina, ma l’analisi della posizione delle mutazioni patogeniche conosciute su .KCNQ4 dimostra che le rnutazioni alterano tutte la regione del poro che è responsabile per la selettività del canale (123).

Il fenotipo delle famiglie portatrici di mutazioni missense del gene KCNQ4 è molto simile (Tabella 11): e presentano un’ipoacusia che insorge prima del decimo anno di età interessando le alte frequenze e progredisce (circa 1 dB all’anno su tutte le frequenze) interessando via via le frequenze medie e gravi fino a divenire severa o profonda attorno ai 40-50 anni, mentre nella famiglia belga con la delezione 211de113, il peggioramento dell’udito alle alte frequenze è cinque volte più rapido che perle altre frequenze (124).

Mutazioni

Famiglia

Modificazioni

proteina

Fenotipo

Insorgenza

Audiogramma

211 del 13

Belga

FS71, R134 stop,
N-terminale

lpoacusia

< 10 aa

Alte freq., progressiva a
tutte le freq. con
progressione rapida  alle
alte freq.

821TA

Olandese

L274H

lpoacusia

< 10 aa

 

827G

Olandese

Giapponese

W276S (regione del poro)

lpoacusia

< 10 aa

Alte freq., progressiva a
tutte le freq

842TC

Americana

L28 1S

lpoacusia

< 10 aa

Alte freq., progressiva a
tutte le freq.profonda nella IV decade di vita

853G T

Americana

G285C(regione del poro)

lpoacusia

< 10 aa

Alte freq., progressiva a
tutte le freq

GA

Francese

G285S

lpoacusia

< 10 aa

Alte freq., progressiva a
tutte le freq

961G A

Olandese

G321S(S6dominio)

lpoacusia

< 10 aa

Alte freq., progressiva a
tutte le freq

 

I canali potassio regolano i segnali elettrici e la composizione ionica dei fluidi biologici. Il ruolo di questo canale regolatore di voltaggio nella funzione uditiva è suggerita dalla sua espressione cellulare e subcellulare nel sistema uditivo centrale e preriferico. KCNQ4 è espresso nelle cellule sensoriali cocleari, sia nelle cellule ciliate interne che esterne, ma anche nelle cellule del ganglio spirale, dci nuclei cocleari, dei nuclei dcl lemnisco laterale e del collicolo inferiore ed è assente in molte altre regioni cerebrali (125). E stato anche descritto un gradiente cocleare basale-apicale della espressione di KCNQ4 che potrebbe spiegare l’iniziale perdita delle alte frequenze nei casi di DFNA2 causati da mutazioni di questo gene che potrebbe essere coinvolto nell’organizzazione tonotopica della coclea.

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Compartimenti della coclea. A: sezione trasversale attraverso il condotto cocleare. B: cellule ciliate interne (IHC). C: cellule ciliate esterne (OHC). D: stria vascularis. Gene nomi dei canali ionici espressi e trasportatori sono illustrati all'interno la posizione approssimativa. DC, le cellule del Deiter; CC, Claudio 'le cellule; HC, cellule di Hensen; OS, le cellule del solco esterne; SC, cellule di supporto; I-V, tipi fibrocyte specializzati.

 

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Fig| Riciclaggio di potassio nella scala media dell'orecchio interno. Il L’endolinfa della scala media ha un'alta concentrazione K + e un potenziale positivo. Potassio secreta nel endolinfa dal stria vascolare entra nelle cellule ciliate attraverso canali meccanosensibili apicali, e probabilmente lascia le cellule ciliate esterne (OHCS) attraverso KCNQ4. Si è riciclato di nuovo alla stria vascolare attraverso le cellule di supporto e fibrociti del legamento spirale per un altro giro di secrezione. In basso a destra: modello di trasporto per secrezione di K + con la stria vascolare. Pompe A basolaterale Na + / K + -ATPasi K + e crea un gradiente di Na + K + da guidare e Cl- nella cellula in un processo( 56) co-trasporto. Chloride è riciclato da canali Cl- basolaterali, e K + è secreta apicale da KCNQ1 KCNE1 / K + canali, che sono aperti alla tensione membrana apicale delle cellule insolito marginali (all'interno positivo di circa 10 mV) 78. Questo permette una secrezione rete in endolymph nonostante la sua alta concentrazione K +. Il potenziale positivo all'interno del supporto scala è probabilmente generato da un epitelio di 'basale' e le cellule "intermedi" che si trovano al di sotto della cellule (79) 'marginali'. L'importanza dei canali KCNQ1 / KCNE1 a K + secrezione è sottolineata dalla sordità dopo mutazioni in entrambe le subunità in JLNS (7,55,80) e KCNE1 knockout mice(11). In basso a sinistra: schema di una cellula ciliata esterna. Il Potassio entra attraverso canali meccanosensibili apicale cui apertura è accoppiato alla deflessione delle stereocilia (83). Nel modello proposto, lascia la cella attraverso canali KCNQ4 K +. esclusivamente presenti nelle membrane basali (19). Il motore di proteine ​​laterale prestin(84) conduce all'amplificazione elettromeccanico di vibrazioni acustiche da OHC. NEURONAL KCNQ POTASSIUM CHANNELS: PHYSIOLOGY AND ROLE IN DISEAS Thomas J. Jentsch NATURE REVIEWS | NEUROSCIENCE           VOLUME 1 | OCTOBER 2000 | 2

7.         Neyroud, N. et al. A novel mutation in the potassium channel gene KVLQT1 causes the Jervell and Lange-Nielsen cardioauditory syndrome. Nature Genet. 15, 186–189 (1997).

11.       Vetter, D. E. et al. Inner ear defects induced by null mutation of the isk gene. Neuron 17, 1251–1264 (1996).The first disruption of the Kcne1 (isk) gene in mice. This thorough study shows a collapse of the scala media shortly after birth. Transepithelial measurements show that the current across the stria vascularis is nearly abolished.

19.       Kharkovets, T. et al. KCNQ4, a K+-channel mutated in a form of dominant deafness, is expressed in the inner ear and in the central auditory pathway. Proc. Natl Acad. Sci. USA 97, 4333–4338 (2000).KCNQ4 antibodies are used to show that, in the inner ear, KCNQ4 is expressed primarily in outer hair cells of the cochlea and in type I hair cells of the vestibular organ. Confirming previous speculation that it may mediate potassium efflux, its expression in outer hair cells is restricted to the basal membrane. Surprisingly, KCNQ4 is also expressed in neurons on the central auditory pathway of the brainstem.

55.       Schulze-Bahr, E. et al. KCNE1 mutations cause Jervell and Lange-Nielsen syndrome. Nature Genet. 17, 267–268 (1997).

56.       Delpire, E., Lu, J., England, R., Dull, C. & Thorne, T. Deafness and imbalance associated with inactivation of the secretory Na-K-2Cl co-transporter. Nature Genet. 22, 192–195 (1999).

78.       Offner, F. F., Dallos, P. & Cheatham, M. A. Positive endocochlear potential: mechanism of production by marginal cells of stria vascularis. Hear. Res. 29, 117–124 (1987).

79.       Wangemann, P., Liu, J. & Marcus, D. C. Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro. Hear. Res. 84, 19–29 (1995).

80.       Tyson, J. et al. IsK and KvLQT1: mutation in either of the two subunits of the slow component of the delayed rectifier potassium channel can cause Jervell and Lange-Nielsen syndrome. Hum. Mol. Genet. 6, 2179–2185 (1997).

83.       Pickles, J. O. & Corey, D. P. Mechanoelectrical transduction by hair cells. Trends Neurosci. 15, 254–259 (1992).

84.       Zheng, J. et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature 405, 149–155 (2000).

Qual è il nome ufficiale del gene KCNQ4?

Il nome ufficiale di questo gene è "canale del potassio, tensione gated KQT come sottofamiglia Q, membro 4."

KCNQ4 è il simbolo ufficiale del gene. Il gene KCNQ4 è conosciuto anche con altri nomi, elencati di seguito.

Per saperne di più sui nomi geni e simboli sulla About pagina.

Qual è la funzione normale del gene KCNQ4?

Il gene KCNQ4 fornisce istruzioni per fare una proteina chiamata potassio canale voltaggio-dipendenti dalla proteina KQT simile 4. La proteina KCNQ4 è parte di una famiglia di proteine ​​che forma i canali per il trasporto di atomi di potassio a carica positiva (ioni potassio) tra le cellule vicine. I canali, realizzati da quattro subunità proteiche, giocano un ruolo chiave nella capacità delle cellule di generare e trasmettere segnali elettrici. La funzione specifica di un canale del potassio dipende dalle sue componenti proteiche e dalla sua posizione nei tessuti. I canali del potassio effettuati con la proteina KCNQ4 trovano nell'orecchio interno e lungo parte del percorso del nervo dall'orecchio al cervello (percorso uditivo). I Canali del potassio KCNQ4 si trovano anche in piccole quantità nel cuore e alcuni muscoli.

Poiché i canali del potassio KCNQ4 siano presenti nell'orecchio interno e percorso uditivo, i ricercatori si sono concentrati sul loro ruolo sulla funzionalità uditiva. L’attività uditiva implica la conversione delle onde sonore in segnali nervosi elettrici. Questa conversione coinvolge molti processi, tra cui il mantenimento del corretto livello di ioni potassio nell'orecchio interno. Anche se il ruolo esatto di canali KCNQ4 rimane sconosciuta, questi canali sembrano essere critici per la trasmissione efficiente dei segnali nervosi elettrici. I canali KCNQ4 possono aiutare al riciclo degli ioni di di potassio all'interno dell'orecchio interno per mantenere il giusto equilibrio di ioni potassio.

Che caratteristiche il gene KCNQ4  condivide con gli altri geni?

Il gene KCNQ4 appartiene ad una famiglia di geni chiamati KCN (canali del potassio).

Una famiglia genica è un gruppo di geni che condividono caratteristiche importanti.  Classificare singoli geni in famiglie aiuta i ricercatori descrivono come i geni sono legati gli uni agli altri. Per ulteriori informazioni, vedere Quali sono famiglie di geni? nel manuale.

Come sono i cambiamenti nel gene KCNQ4 relativi alle condizioni di salute?

Sordità sindromica - causata da mutazioni nel gene KCNQ4

Diverse mutazioni del gene KCNQ4 sono stati riportati in soggetti con una forma di sordità non sindromica (perdita di udito senza segni e sintomi correlati che interessano altre parti del corpo) chiamato DFNA2. La maggior parte delle mutazioni del gene KCNQ4 modificano uno degli elementi costitutivi (aminoacidi) usato per fare la proteina KCNQ4. Quasi tutti questi cambiamenti riguardano la regione della proteina che forma il poro o il canale apertura. Di conseguenza, il canale non funziona correttamente e normali livelli di ioni potassio può essere disturbato. Due mutazioni eliminano parte del gene KCNQ4, che si traduce in un piccola proteina KCNQ4 anormale che non può formare canali funzionali. Non è chiaro se i risultati sulla sordità sia influenzata  dai livelli di potassio all'interno dell'orecchio interno, da alterazioni della via uditiva, o entrambe.

Dove si trova il gene KCNQ4?

Citogenetica Località: 1p34

Posizione molecolare sul cromosoma 1: coppie di basi 40.784.011 a 40.840.451

http://ghr.nlm.nih.gov/html/images/blank1.gifIl gene KCNQ4 si trova sul breve (p) braccio del cromosoma 1 alla posizione 34.

Il gene KCNQ4 si trova sul breve (p) braccio del cromosoma 1 alla posizione 34.

Più precisamente, il gene KCNQ4 si trova dalla coppia di basi 40.784.011 di paia di basi 40.840.451 sul cromosoma 1.

Vedi Come genetisti indicano la posizione di un gene? nel manuale.

Dove posso trovare ulteriori informazioni su KCNQ4?

Tu e il tuo operatore sanitario possono trovare le seguenti risorse circa KCNQ4 utile.

·         Risorse educative - Pagine di informazioni (2 collegamenti)

·         Recensioni Gene - riassunto Clinica (2 collegamenti)

·         Test genetici Registry - archivio di informazioni test genetico (1 link)

Si può anche essere interessati a queste risorse, che sono progettati per i professionisti e ricercatori di genetica.

·         PubMed This link leads to a site outside Genetics Home Reference. - La letteratura recente

·         OMIM This link leads to a site outside Genetics Home Reference. - Catalogo disturbo genetico

·         Research Resources - Strumenti per i ricercatori (5 collegamenti)

Quali altri nomi la gente usa per il gene KCNQ4 o prodotti di geni?

  • DFNA2
  • KCNQ4_HUMAN
  • KQT-like 4
  • KV7.4
  • canale del potassio voltaggio-dipendenti, KQT come sottofamiglia, membro 4


Riferimenti

Queste fonti sono stati utilizzati per sviluppare il Genetics Home Reference sintesi gene sul geneKCNQ4.

·     Coucke PJ, Van Hauwe P, Kelley PM, Kunst H, Schatteman io, Van Velzen D, J Meyers, Ensink RJ, Verstreken M, Declau F, Marres H, K Kastury, Bhasin S, McGuirt WT, Smith RJ, Cremers CW, Van de Heyning P, Willems PJ, Smith SD, Van Camp G. Le mutazioni nel gene KCNQ4 sono responsabili per autosomica dominante sordità in quattro famiglie DFNA2. Hum Mol Genet. 1999 luglio, 8 (7):. 1321-8 PubMed citazione This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     Finsterer J, J. Fellinger nucleare e geni mitocondriali mutati in problemi di udito non sindromica. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2005 Maggio; 69 (5): 621-47. Recensione. PubMed citazione This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     Kamada F, Kure S, T Kudo, Suzuki Y, Oshima T, Ichinohe A, Kojima K, Niihori T, J Kanno, Narumi Y, Narisawa A, Kato K, Aoki Y, Ikeda K, Kobayashi T, Matsubara Y. Un romanzo KCNQ4 delezione uno-base in un grande pedigree con perdita di udito: implicazioni per la correlazione genotipo-fenotipo. J Hum Genet. 2006; 51 (5): 455-60. Epub 2006 Aprile 5. PubMed citazione This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     Kubisch C, Schroeder aC, Friedrich T, Lütjohann B, El-Amraoui A, Marlin S, Petit C, Jentsch TJ.KCNQ4, un canale del potassio romanzo espresso in cellule ciliate esterne sensoriali, è mutato in sordità dominante. Cell. 1999 5 febbraio; 96 (3):. 437-46 PubMed citazione This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     NCBI Gene This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     OMIM: POTASSIO CHANNEL, voltaggio-dipendenti, KQT-SIMILI SOTTOFAMIGLIA, MEMBRO 4 This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     Wangemann P. K (+) in bicicletta e la sua regolamentazione nella coclea e il labirinto vestibolare.Audiol Neurootol. 2002 Luglio-Agosto; 7 (4): 199-205 PubMed citazione. This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

·     Willems PJ. Cause genetiche della perdita dell'udito. N Engl J Med. 13 aprile 2000; 342 (15): 1101-9. Recensione. PubMed citazione This link leads to a site outside Genetics Home Reference.

Malattie dei canali ionici

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Figura 1. Vie di trasporto nell'orecchio interno e nel rene (spessore ascendente arto). Lo schema principale mostra un condotto cocleare, mettendo in evidenza le proposte K + ioni percorsi di riciclaggio. La funzionalità uditiva  dipende da un alto K +concentrazione (150 m M )per la balneazione le membrane apicali delle cellule ciliate sensorie. Durante la stimolazione sonora, K +entra nelle cellule dei capelli attraverso canali cationici meccanosensibili apicali. K + esce dalle cellule ciliate esterne, probabilmente attraverso KCNQ4 K + canali. K + viene poi ripreso con il K-Cl co-trasportatore KCC4 sostenendo cellule Deiters (mostrato in dettaglio in alto a sinistra). K + passa fibrociti della parete laterale attraverso giunzioni gap al vascularis stria, dove viene pompato nel endolinfa. Nelle cellule marginali striali (ingrandimento sotto), NKCC1 basolaterale solleva intracellulare K + concentrazione. Canali paralleli CLC-Ka / barttin e CLC-Kb / barttina riciclano Cl - . K + esce attraverso canali apicale contenenti subunità KCNQ1 e KCNE1 subunità. Perdita di KCNQ1, KCNE1, NKCC1 o barttina causa la sordità negli esseri umani e nei topi. Né perdita di CLC-Ka, né di CLC-Kb solo comporta la sordità. Nelle cellule del tratto ascendente spessa renale (nel riquadro), apicali NKCC2 co-trasportatori guida Cl - captazione richiedono ROMK riciclare K + . Cl - esce attraverso canali contenenti CLC-Kb subunità α e β barttina subunità. Le mutazioni in tutti e quattro i geni causano la sindrome di Bartter.

 

 

 

 

 

References

1.    Jump up^ Kubisch C, Schroeder BC, Friedrich T, Lutjohann B, El-Amraoui A, Marlin S, Petit C, Jentsch TJ (Mar 1999). "KCNQ4, a novel potassium channel expressed in sensory outer hair cells, is mutated in dominant deafness". Cell 96 (3): 437–46. doi:10.1016/S0092-8674(00)80556-5PMID 10025409.

2.    Jump up^ Gutman GA, Chandy KG, Grissmer S, Lazdunski M, McKinnon D, Pardo LA, Robertson GA, Rudy B, Sanguinetti MC, Stuhmer W, Wang X (Dec 2005). "International Union of Pharmacology. LIII. Nomenclature and molecular relationships of voltage-gated potassium channels". Pharmacol Rev57 (4): 473–508. doi:10.1124/pr.57.4.10PMID 16382104.

3.    Jump up to:a b c "Entrez Gene: KCNQ4 potassium voltage-gated channel, KQT-like subfamily, member 4".

4.    Jump up^ Yu H, Wu M, Townsend SD, et al. (2011). "Discovery, Synthesis, and Structure Activity Relationship of a Series of N-Aryl- bicyclo[2.2.1]heptane-2-carboxamides: Characterization of ML213 as a Novel KCNQ2 and KCNQ4 Potassium Channel Opener"ACS Chem Neurosci 2 (10): 572–577.doi:10.1021/cn200065bPMC 3223964PMID 22125664.

 

 

Further reading

  • Iannotti FA, Barrese V, Formisano L, Taglialatela M (Feb 2013). "Specification of skeletal muscle differentiation by repressor element-1 silencing transcription factor (REST)-regulated Kv7.4 potassium channels.". Mol Biol Cell. 24 (3): 274–84. doi:10.1091/mbc.E11-12-1044PMID 23242999.

 

 

APPROFONDIMENTO

DFNA2 non sindromica perdita dell'udito

Richard JH Smith, MD e Michael Hildebrand, PhD.

Autore Informazioni

Distacco iniziale: 4 apr 2008; Ultimo aggiornamento: 20 agosto 2015.

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Sommario

Caratteristiche cliniche.

DFNA2 perdita di udito non sindromica è caratterizzata da simmetria, prevalentemente ad alta frequenza ipoacusia neurosensoriale (SNHL), che è progressiva su tutte le frequenze. In giovane età, la perdita dell'udito tende ad essere mite nelle frequenze basse e moderato nelle alte frequenze; nelle persone anziane, la perdita dell'udito è moderato nelle frequenze basse e grave a profonda nelle alte frequenze. Anche se l'indebolimento dell'udito è spesso rilevato durante la valutazione audizione di routine di un bambino in età scolare, è probabile che l'udito è compromessa dalla nascita, soprattutto alle alte frequenze. La maggior partecolpiti persone inizialmente richiedono apparecchi acustici per assistere con amplificazione del suono tra le età di dieci e 40 anni. In età di 70 anni, tutte le persone con DFNA2 perdita di udito non sindromica hanno insufficienza uditiva grave a profonda.

Diagnosi / testing.

La diagnosi di DFNA2 perdita di udito non sindromica è stabilito in un individuo con una audioprofile caratteristica, una storia di famiglia coerente con autosomica dominante ereditarietà e l'identificazione di una variante la sordità legata in KCNQ4.

Gestione.

Trattamento delle manifestazioni: Apparecchi acustici per le persone con perdita dell'udito da lieve a moderata; considerazione di impianti cocleari quando la perdita dell'udito è grave a profonda; assistenza speciale a scuola per i bambini e gli adolescenti con problemi di udito.

Sorveglianza: Al audiogramma almeno annuale di seguire la progressione di perdita dell'udito.

Agenti / circostanze da evitare: Evitare l'esposizione a rumori forti può ridurre il tasso di progressione del SNHL ad alta frequenza.

La valutazione dei parenti a rischio: determinazione durante l'infanzia o nella prima infanzia se un membro della famiglia del probando ha ereditato una variante la sordità legata a KCNQ4 permette sostegno precoce e la gestione del bambino e della famiglia.

Consulenza genetica.

DFNA2 perdita di udito non sindromica è ereditata come autosomica dominante maniera.La maggior parte degli individui con DFNA2 perdita di udito non sindromica hanno un genitore con perdita di udito; la percentuale di individui con una variante de novo sordità relativo è sconosciuta. Ogni figlio di un individuo con DFNA2 perdita di udito non sindromica ha una probabilità del 50% di ereditare la variante sordità legate. Test prenatale per gravidanze a rischio è possibile se la KCNQ4 variante sordità legata è stata identificata in un membro della famiglia.

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Diagnosi

Risultati Suggestive

DFNA2 perdita di udito non sindromica deve essere sospettata in individui con:

  • Simmetrica, prevalentemente ad alta frequenza ipoacusia neurosensoriale (SNHL), che è progressiva su tutte le frequenze:
    • In giovane età, la perdita dell'udito tende ad essere mite nelle frequenze basse e moderato nelle alte frequenze.
    • Nelle persone anziane, la perdita dell'udito è moderato nelle frequenze basse e grave a profonda nelle alte frequenze.
  • Esame fisico normale
  • Storia familiare di perdita di udito coerente con autosomica dominante ereditarietà
  • Imaging osso temporale (cioè, CT delle orecchie interne) è normale. In particolare, anomalie come dilatazione delle acquedotti vestibolari (noto anche come acquedotti vestibolari ingrandita) e Mondini displasia dovrebbero essere assente.

Stabilire la diagnosi

La diagnosi di DFNA2 perdita di udito non sindromica è stabilito in un probando con il audioprofile caratteristiche di cui sopra e l'identificazione di una variante eterozigote sordità legate a KCNQ4 su test di genetica molecolare (vedi tabella 1).

Metodi di analisi molecolari possono includere singolo gene sperimentazione, l'uso di un pannello multi-gene,e test genomico.

  • Singolo gene test. Analisi della sequenza di KCNQ4 viene eseguita prima seguita da gene targetinganalisi delezione / duplicazione se non viene trovata alcuna variante sordità legate.
  • Un multi-gene pannello che include KCNQ4 e altri geni di interesse (vedi Diagnosi differenziale) può anche essere considerata [Kothiyal et al 2010, Shearer et al 2010, Shearer & Smith 2015]. Nota: I geni inclusi e sensibilità di pannelli multi-gene variano da laboratorio e nel tempo.
  • Test genomico può essere presa in considerazione se singola seriale gene testing (e / o l'uso di un pannello multi-gene) non hanno confermato la diagnosi in un individuo con caratteristiche di DFNA2 perdita di udito non sindromica. I test possono includere tutto il sequenziamento dell'esoma (WES), all'in- grosso del genoma sequenziamento (WGS), e il sequenziamento dell'intero mitocondriale (WMitoSeq). 

    Per problemi da considerare nella interpretazione dei risultati dei test genomici, clicca 
    qui.

Tabella 1.

Ricerca di genetica molecolare Utilizzato in DFNA2 non sindromica perdita dell'udito

Gene 1

Metodo di prova

Percentuale di probandi con una sordità-Related Variante 2 rilevabili con questo metodo

KCNQ4

Le analisi della sequenza 3

100% 4

Gene targeting delezione / duplicazione analisi 5

Sconosciuto 6

1.

Vedi Tabella Geni A. e database per cromosoma locus e proteine.

2.

Vedere Genetica Molecolare per informazioni sulle varianti alleliche rilevati in questo gene.

3.

Le analisi della sequenza rileva le varianti che sono benigni, probabilmente benigno, di significato incerto, probabilmente la sordità legata, o sordità correlati. Varianti sordità correlati possono includere piccole intragenica delezioni / inserzioni e missense, nonsense, e varianti sito di splicing; tipicamente, esone o all'in- grosso gene delezioni / duplicazioni non vengono rilevati. Per problemi da considerare nell'interpretazione di analisi di sequenza risultati, fare clic qui.

4.

Le analisi della sequenza rileva varianti sordità legate a KCNQ4 in quasi tutti gli individui con autosomica dominanteperdita dell'udito neurosensoriale non sindromica che mappa il DFNA2 locus.

5.

Gene targeting analisi delezione / duplicazione rileva delezioni o duplicazioni intragenica. I metodi che possono essere utilizzati possono includere: PCR quantitativa, a lungo raggio PCR, multiplex ligation-dipendente probe amplificazione (MLPA), e un gene microarray -targeted progettato per rilevare mono esone delezioni o duplicazioni.

6.

Nessun dato relativo tasso di rilevamento di gene -targeted analisi delezione / duplicazione sono disponibili.

Geneticamente Correlate (alleliche) Disturbi

Nessun fenotipi diversi da quelli discussi in questo GeneReview sono noti per essere associati con varianti sordità correlati al KCNQ4.

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Caratteristiche cliniche

Descrizione clinica

Tutte le famiglie con DFNA2 perdita di udito non sindromica hanno simmetrico, ad alta frequenza di perdita prevalentemente udienza, che è progressiva su tutte le frequenze. Una rassegna completa della presentazione clinica e la prognosi di individui con diagnosi di DFNA2 perdita di udito non sindromica è stata fornita da De Leenheer et al [2002a].

L'esordio di perdita dell'udito è generalmente riportato nella prima infanzia o l'adolescenza; Tuttavia, è probabile che l'udito è compromessa dalla nascita, soprattutto alle alte frequenze. La perdita dell'udito è spesso rilevato durante la valutazione audizione standard di un bambino in età scolare o meno frequentemente durante la valutazione di un figlio per ritardato sviluppo del linguaggio.

In tutti colpiti gli individui la perdita dell'udito è più grave alle alte frequenze, risultando in un caratteristico audioprofile downsloping con udito soglie tra 50 e 90 dB a 500 Hz e tra i 90 e 120 dB a 2 kHz e 4 kHz dall'età di 50 anni. Un audiogramma tipico di un adolescente con perdita di udito nonsyndromic DFNA2 è mostrato inFigura 1.

Figura 1. . Audiogramma da un 12-year-old con DFNA2 perdita dell'udito Nota che la perdita è maggiore nelle alte frequenze.

Figura 1.

Audiogramma da un 12-year-old con perdita di udito DFNA2 
Si noti che la perdita è maggiore alle alte frequenze. Con il tempo, l'udito a tutte le frequenze si deteriora progressivamente.

Mentre l'età insorgenza varia all'interno di famiglie, deterioramento delle soglie annuali per le famiglie con DFNA2 perdita di udito non sindromica è stata calcolata in un relativamente uniforme ~ 1 dB / anno [Coucke et al 1999, Talebizadeh et al 1999, Ensink et al 2000, Van Hauwe et al 2000, Akita et al 2001, De Leenheer et al 2002a, De Leenheer et al 2002b, Van Camp et al 2002]. La maggior parte delle persone con DFNA2 perdita di udito non sindromica vengono prima dotati di apparecchi acustici per assistere con amplificazione del suono tra le età di dieci e 40 anni [De Leenheer et al 2002a]. In età di 70 anni, tutte le persone con perdita dell'udito attribuiti ad una variante la sordità legata in KCNQ4 hanno grave perdita di udito a profonda.

Altri risultati

  • Funzione vestibolare Trenta per cento di individui in due famiglie con DFNA2 perdita di udito non sindromica (famiglie olandesi 1 e 4;. Tabella 3) era aumentata attività riflesso vestibolo-oculare [Marres et al 1997, De Leenheer et al 2002b]. Problemi vestibolari non sono state osservate in tutte le altre famiglie con DFNA2 perdita di udito non sindromica.
  • Punteggi di riconoscimento vocale. Misurato in diverse famiglie olandesi, i punteggi di riconoscimento vocale sono stati relativamente buoni date le soglie puro-tono [De Leenheer et al 2002b, Van Camp et al 2002].

Genotipo-fenotipo Correlazioni

Il fenotipo associata con KCNQ4 varianti missenso sordità relativo è simile in tutte le famiglie: prevalentemente ad alta frequenza ipoacusia neurosensoriale (SNHL) che è rilevabile nell'infanzia e progressiva su tutte le frequenze. In giovane età, la perdita dell'udito tende ad essere mite nelle frequenze basse e moderato nelle alte frequenze. Nelle persone anziane, la perdita dell'udito è moderato nelle frequenze basse e grave a profonda nelle alte frequenze.

Il fenotipo associata con varianti KCNQ4 il troncamento è diverso da quello associato con le varianti missensoKCNQ4 sordità-correlati. In due famiglie, piccole delezioni frameshift di KCNQ4 (c.211_223del e c.211delC)sono previsti per provocare una proteina troncata profondamente che o non interagisce con normale proteina tradotta del normale allele o non rimanga nelle cellule a causa di nonsense-mediata decay. La perdita dell'udito associati a questo effetto dosaggio è più mite in frequenze medie e basse, più severe in alte frequenze, e più tardi nella insorgenza della perdita dell'udito visto con varianti missenso sordità legata [Coucke et al 1999, Akita et al 2001].

Penetranza

La penetranza è completa. Tutti gli individui con una variante KCNQ4 sordità legata mostrano la perdita di udito fenotipo; età di esordio e la gravità sono variabili.

Prevalenza

Non ci sono dati sulla prevalenza di DFNA2 tra famiglie segregante autosomica dominante perdita di udito non sindromica (ADNSHL) sono disponibili. Aneddoticamente, tuttavia, le varianti sordità legate a KCNQ4 sono pensati per rappresentare fino al 5% di ADNSHL [R Smith, comunicazione personale].

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Diagnosi differenziale

Vedere Sordità ed Ereditaria Panoramica perdita dell'udito per la diagnosi differenziale completa.

Perché varianti in KCNQ4 sono una causa relativamente comune di alta frequenza autosomica dominanteperdita di udito non sindromica (ADNSHL), KCNQ4 dovrebbe essere tra i primi geni testati in famiglie con questo tipo di ipoacusia.

Varianti nei seguenti geni causano anche ADNSHL alta frequenza:

  • GJB3 (DFNA3)
  • COCH (DFNA9)
  • POU4F3 (DFNA15)

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Gestione

Le valutazioni dopo la diagnosi iniziale

Per stabilire l'entità della perdita e bisogni in un individuo con diagnosi di DFNA2 perdita di udito non sindromica dell'udito, si raccomandano i seguenti:

  • Audiometria, compresi test conduzione ossea
  • Consultazione con un genetista medico e / o un consulente genetico

Trattamento delle manifestazioni

Quando la perdita dell'udito è da lieve a moderata, applicazione di apparecchi acustici per fornire una migliore amplificazione è giustificata.

Quando la perdita dell'udito diventa grave a profondi, impianti cocleari (IC) può essere considerato. Negli individui con problemi di udito a bassa frequenza conservato o relativamente buona e la perdita di alta frequenza grave a profonda, una breve elettrodi può essere considerato. Elettrodi brevi aumentare le alte frequenze, preservando residuo dell'udito a bassa frequenza.

Per i bambini in età scolare e negli adolescenti, assistenza speciale per i non udenti può essere giustificata e, se disponibili, dovrebbe essere offerto.

Sorveglianza

Audiogrammi devono essere ottenuti su base annuale a seguire la progressione di perdita dell'udito.

Agenti / Circostanze da evitare

Il tasso di progressione di perdita dell'udito ad alta frequenza può essere ridotta, incoraggiando le persone con DFNA2 perdita di udito non sindromica per evitare l'esposizione a rumori forti nei luoghi di lavoro e durante la ricreazione.

Valutazione del Parenti a rischio

Determinazione durante l'infanzia o nella prima infanzia se un familiare di una persona con DFNA2 perdita di udito non sindromica ha ereditato la variante KCNQ4 sordità legata permette il supporto precoce e la gestione del bambino e della famiglia.

Le valutazioni possono includere:

Vedere consulenza genetica per le questioni legate alla sperimentazione di a rischio parenti per consulenza genetica scopi.

Terapie Sotto inchiesta

Cerca ClinicalTrials.gov per l'accesso alle informazioni su studi clinici per una vasta gamma di malattie e condizioni. Nota: Non ci possono essere gli studi clinici per questa condizione.

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Consulenza genetica

La consulenza genetica è il processo di fornitura di individui e famiglie con informazioni sulla natura, l'ereditarietà, e le implicazioni di malattie genetiche per aiutarli a prendere decisioni personali e mediche informate. I seguenti sezione tratta la valutazione del rischio genetico e l'uso della storia familiare e test genetici per chiarire lo status genetico per i familiari. Questa sezione non è destinata a affrontare tutte le questioni personali, culturali, etiche o che gli individui possono affrontare o per sostituire la consultazione con una genetica professionale. -ED.

Modalità di eredità

DFNA2 perdita di udito non sindromica è ereditata come autosomica dominante maniera.

Rischio per i familiari

I genitori di un probando

  • La maggior parte degli individui con diagnosi di DFNA2 perdita di udito non sindromica hanno un genitore sordo.
  • Un probandi con DFNA2 perdita di udito non sindromica può avere la sordità come il risultato di un de novo variante KCNQ4. La percentuale di individui con una variante KCNQ4 de novo sordità relativo è sconosciuta.
  • Se la variante sordità legata trovata nel probandi non può essere rilevata nel leucociti DNA di entrambi i genitori, due possibili spiegazioni sono una variante de novo sordità legata nei probandi o mosaicismo germinale in un genitore. Sebbene non siano stati riportati casi di mosaicismo germinale, rimane una possibilità.
  • Raccomandazioni per la valutazione dei genitori di un probando con un apparente de novo variante sordità legata includono audiometria e test di genetica molecolare. La valutazione dei genitori può stabilire che uno ha la perdita dell'udito, ma è sfuggito precedente diagnosi a causa di una presentazione fenotipica più lieve. Pertanto, un apparentemente negativa storia di famiglia non può essere confermata fino a quando sono state eseguite le valutazioni del caso.

Nota: (1) Anche se la maggior parte degli individui con diagnosi di DFNA2 perdita di udito non sindromica hanno un genitore sordo, oltre al mancato riconoscimento perdita di membri della famiglia l'udito, la storia della famiglia può sembrare negativo a causa della morte precoce del genitore prima dell'inizio della perdita o tardiva insorgenza di perdita di udito in un genitore udienza. (2) Se il genitore è l'individuo, in cui si è verificato prima la variante sordità legata, s / egli può avere somatica mosaicismo per la variante la sordità legati e hanno la perdita dell'udito lieve.

Fratelli e sorelle di un probando

  • La probabilità che i fratelli del probando saranno sordi dipende dallo stato genetico dei genitori del probando.
  • Se un genitore del probando è sordo, ogni sib ha una probabilità del 50% di essere sordo.
  • Quando i genitori stanno ascoltando, la probabilità che un sib del probando sarà appare sordi a essere bassa.
  • Se la variante sordità legata trovato nel probando non può essere rilevato in leucociti DNA di entrambi i genitori, la probabilità che un sib sarà sordi è basso, ma superiore a quella della popolazione generale a causa della possibilità di mosaicismo germinale.

Prole di un probando. Ogni figlio di un individuo con DFNA2 perdita di udito non sindromica ha una probabilità del 50% di ereditare la variante sordità legate.

Altri membri della famiglia di un probando

  • La probabilità di sordità in altri membri della famiglia dipende dallo stato delle probando genitori s '.
  • Se un genitore è sordo, i suoi familiari possono anche essere sordi o sviluppare sordità.

Genetica Related Issues Counseling

Vedere Gestione, Valutazione di parenti a rischio per le informazioni sulla valutazione parenti di un probando ai fini della diagnosi e la gestione precoce.

Ulteriori punti da considerare sono i seguenti:

  • La comunicazione con le persone che sono sordi richiede i servizi di un interprete qualificato.
  • Alcune persone non udenti possono visualizzare la sordità come una caratteristica distintiva e non come un handicap, perdita di valore, o uno stato patologico da "impedire" o che richiedono un "trattamento" o "cura". In effetti, per alcuni individui sordi, avere un bambino sordo può essere preferito avere un figlio con udito normale. Gli atteggiamenti e le preferenze possono variare a seconda del tipo di perdita dell'udito, esperienze personali, e le comunità con le quali gli individui identificare.
  • Molte persone sorde sono interessati ad ottenere informazioni sulla causa della loro sordità informazioni anche per quanto riguarda i servizi sanitari, educativi e sociali piuttosto che informazioni circa la prevenzione, la riproduzione o la pianificazione familiare. Come in tutta la consulenza genetica, è importante per il consulente di individuare, riconoscere e rispettare / della famiglia dell'individuo domande, dubbi e paure.
  • L'uso di alcuni termini è preferito: probabilità o possibilità vs rischio; non udenti e di udito contro udenti.Termini come "affetto", "anormale" e "che causano malattie" dovrebbero essere evitati.

Considerazioni in famiglie con un apparente de novo variante. Quando nessuno dei genitori di un probandocon DFNA2 perdita di udito non sindromica ha la variante sordità legata o evidenza clinica di sordità, è probabile che i probandi ha una variante de novo. Tuttavia, possibili spiegazioni non mediche potrebbero essere esplorati compresa la paternità alternativo o di maternità (ad esempio, con la riproduzione assistita) o l'adozione riservate.

Pianificazione famigliare

  • Il momento ottimale per la determinazione dello status di genetica e discussione della disponibilità di test prenatale è prima della gravidanza.
  • È opportuno offrire una consulenza genetica (compresa la discussione della probabilità che i figli sarà opzioni sordi e riproduttivi) di giovani adulti che hanno DFNA2 perdita di udito non sindromica.

Banking DNA è la conservazione di DNA (tipicamente estratto da globuli bianchi) per un possibile uso futuro.Poiché è probabile che la metodologia di prova e la nostra comprensione dei geni, varianti alleliche, e sordità miglioreranno in futuro, occorre tenere in considerazione per bancaria DNA delle persone fisiche con DFNA2 perdita di udito non sindromica.

Test prenatale

Se la variante KCNQ4 sordità legata è stata identificata in un membro della famiglia, test prenatale può essere disponibile da un laboratorio clinico che offre sia la sperimentazione di questo gene o test prenatale personalizzato.

Possono esistere differenze di prospettiva tra i professionisti medici e all'interno delle famiglie per quanto riguarda l'uso di test prenatali, in particolare se il test viene presa in considerazione ai fini della interruzione della gravidanza, piuttosto che la diagnosi precoce. Sebbene la maggior parte centri prenderebbero in considerazione decisioni su test prenatale per essere la scelta dei genitori, la discussione di questi problemi è appropriato.

Diagnosi genetica preimpianto (PGD) può essere un'opzione per alcune famiglie nelle quali è stata identificata la KCNQ4 variante sordità legate.

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Risorse

Personale GeneReviews ha selezionato le seguenti organizzazioni malattia-specifici e / o di supporto ombrello e / o registri per il beneficio di soggetti con questo disturbo e le loro famiglie. GeneReviews non è responsabile per le informazioni fornite da altre organizzazioni. Per informazioni sui criteri di selezione, clicca qui.

  • National Library of Medicine Genetics Home Reference

La sordità non sindromica

  • Alexander Graham Bell Associazione per sordi e udenti

3417 Volta Luogo Northwest

Washington DC 20007

Telefono: 866-337-5220 (numero verde); 202-337-5220; 202-337-5221 (TTY)

Fax: 202-337-8314

Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

Ascolto e Lingua parlata Knowledge Center

  • American Society for bambini sordi (ASDC)

800 Florida Avenue Northeast

Suite 2047

Washington DC 20002-3695

Telefono: 800-942-2732 (numero verde Parent Hotline); 866-895-4206 (voce verde / TTY)

Fax: 410-795-0965

E-mail: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

www.deafchildren.org

  • udito del mio bambino

Il sito, sviluppato con il sostegno del National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione, fornisce informazioni su screening uditivo neonatale e perdita dell'udito.

www.babyhearing.org

  • Associazione Nazionale dei Sordi (NAD)

8630 Fenton Street

Suite 820

Silver Spring MD 20910

Telefono: 301-587-1788; 301-587-1789 (TTY)

Fax: 301-587-1791

Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

www.nad.org

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Genetica molecolare

Le informazioni contenute in tabelle Genetica Molecolare e OMIM può differire da quello in altre parti del GeneReview: tavoli può contenere informazioni più recenti. - ED.

Tabella A.

DFNA2 non sindromica La perdita dell'udito: Geni e database

Locus Nome

Gene

Cromosoma Locus

Proteina

Locus specifico

HGMD

DFNA2

KCNQ4

1p34 .2

Sottofamiglia canale del potassio voltaggio-dipendenti KQT membro 4

Sordità Gene Mutation Database (KCNQ4) 
Database KCNQ4

KCNQ4

I dati sono compilati dai seguenti riferimenti standard: gene da HGNC; cromosoma locus, nome luogo, regione critica, complementazione gruppo da OMIM; proteine ​​da UniProt. Per una descrizione di database (Locus specifico, HGMD) a cui vengono forniti i link, clicca qui.

Tabella B.

OMIM Voci per DFNA2 non sindromica perdita dell'udito (Vedi tutti in OMIM)

600.101

SORDITA ', AUTOSOMICA 2A DOMINANTE; DFNA2A

603.537

CANALE DEL POTASSIO, voltaggio-dipendenti, KQT-SIMILI SOTTOFAMIGLIA, MEMBRO 4; KCNQ4

KCNQ4

Gene struttura. KCNQ4 ha una lunghezza di 2.335 trascrizione coppie di basi. La trascrizione è composto da 14 esoni. Per un riepilogo dettagliato delle gene informazioni e proteine, vedi tabella A, Gene.

Varianti di significato clinico incerto. Due varianti alleliche che provocano cambiamenti di aminoacidi sinonimo siano clinicamente significative incerto (vedi tabella 2). Questi nucleotidi varianti sono state rilevate su uno schermo di 185 individui con perdita di udito non sindromica. Questi individui sono stati segnalati ad avere perdita di udito non sindromica; nessuna informazione per quanto riguarda la storia familiare è stata fornita.

Tabella 2.

Selezionati KCNQ4 Varianti di significato incerto clinica

DNA Nucleotide Change

Proteine ​​Amino Acid Change 
(Alias 
​​1)

Proteine ​​Dominio

Popolazione

L'insorgenza di sintomi 2

Riferimento

c.648C> T

p. = 3 
(Arg216Arg)

S4 dominio transmembrana

Taiwanese

Infanzia

Su et al [2007]

c.1503C> T

p. = 3 
(Thr501Thr)

Distale S6 dominio transmembrana

Nota sulla classificazione variante: Varianti elencate nella tabella sono stati forniti dagli autori personale GeneReviews non sono verificate in modo indipendente la classificazione delle varianti..

Nota sulla nomenclatura: GeneReviews segue le convenzioni di denominazione standard del Genome Variation società umana(www .hgvs.org). Vedere di riferimento rapido per una spiegazione di nomenclatura.

1.

Designazione Variante che non è conforme alle convenzioni di denominazione corrente

2.

Patologia era alta frequenza insufficienza uditiva e l'espressione tessuto-specifica era in cellule ciliate esterne cocleari e cervello per tutte le varianti sordità legate descritti nella tabella.

3.

Per queste varianti, "p. =" Indica che alcun effetto sul livello di proteina è previsto.

Varianti alleliche patogeni. Più sordità legati varianti cluster esoni 5, 6, e 7 del KCNQ4. Questi esoni codifichi altamente conservati sequenze di amminoacidi che formano il poro canale. Le varianti sordità legati predominanti sono varianti missenso che inducono una dominante effetto -negativa. La variante p.Trp276Ser sordità legati sembra essere più comune ed è stato identificato in quattro famiglie non imparentate, di cui tre di cinque famiglie olandesi con DFNA2 perdita di udito non sindromica (vedi tabella 3). La quarta famiglia è giapponese. Insorgenza congenita di DFNA2 perdita di udito non sindromica è stata riportata in una delle famiglie olandesi con la variante p.Trp276Ser [De Leenheer et al 2002b, Van Camp et al 2002], ma non in altre famiglie con questa variante la sordità legate. La perdita dell'udito ad alta frequenza in questa famiglia è stata progressiva, senza sostanziale perdita di riconoscimento vocale nel corso dei primi decenni di vita [De Leenheer et al 2002b].

Tabella 3.

Selezionata KCNQ4 Sordità-Related allelica varianti

DNA Nucleotide Change 
(Alias 
​​1)

Proteine ​​Amino Acid Change 
(Alias 
​​1)

Proteine ​​Dominio

Popolazione

L'insorgenza di sintomi 2

Riferimento

c.211_223del13 
(211del13)

p.Gln71ProfsTer64 
(Q71fs * 134)

Citoplasmatica N-terminale

belga

Adolescenza

Coucke et al [1999]

c.211delC

p.Gln71SerfsTer68 
(FS71)

Citoplasmatica N-terminale

giapponese

Adolescenza

Kamada et al [2006], Ishikawa et al [2014]

c.228_229dupGC

p.His77ArgfsTer63

Citoplasmatica N-terminale

giapponese

Infanzia

Naito et al [2013]

c.546C> G

p.Phe182Leu

S3 dominio transmembrana

Taiwanese

Infanzia

Su et al [2007]

c.667_684del18 
(664_681del)

p.Thr223_Gly228del
(Gly222_Leu227del)

Anello Intra-membrana

Corea del Sud

Infanzia

Baek et al [2011]

c.689T> A

p.Val230Glu

S4-S5 linker

giapponese

Infanzia

Naito et al [2013]

c.778G> A

p.Glu260Lys

S5 dominio transmembrana

nordamericano

Infanzia

Hildebrand et al [2008]

c.785A> T

p.Asp262Val

S5 dominio transmembrana

nordamericano

Infanzia

Hildebrand et al [2008]

c.725G> A

p.Trp242Ter

S5 dominio transmembrana

nordamericano

Infanzia

Hildebrand et al [2008]

c.806_808delCCT

p.Ser269del

Tra il dominio S5 e elica poro

canadese

Infanzia

Abdelfatah et al [2013]

giapponese

Età adulta

Watabe et al [2013]

c.808T> C

p.Tyr270His

Elica Pore

giapponese

Congenita

Namba et al [2012]

c.821T> A

p.Leu274His

P-loop

olandese

Infanzia

Van Hauwe et al [2000], de Heer e altri [2011]

c.823T> C

p.Trp275Arg

P-loop

Han cinese

Infanzia

Wang ed altri [2014]

c.827G> C

p.Trp276Ser

P-loop

Olandese, Giapponese

Infanzia

Coucke et al [1999],Van Camp et al [2002], Topsakal et al [2005]

c.842T> C

p.Leu281Ser

P-loop

nordamericano

Infanzia

Talebizadeh et al [1999]

c.853G> T

p.Gly285Cys

P-loop

nordamericano

Infanzia

Coucke et al [1999]

c.853G> A

p.Gly285Ser

P-loop

Nord-europeo, cinese Han

Infanzia

Kubisch et al [1999], Wang et al [2014]

c.859G> C

p.Gly287Arg

P-loop

nordamericano

Infanzia

Arnett et al [2011]

c.871C> T

p.Pro291Ser

Poro del canale

giapponese

Età adulta

Naito et al [2013]

c.872C> T

p.Pro291Leu

Poro del canale

giapponese

Adolescenza

Naito et al [2013]

c.886G> A

p.Gly296Ser

Poro del canale

spagnolo

Infanzia

Mencía et al [2008]

c.891G> T

p.Arg297Ser

S6 dominio transmembrana

giapponese

Infanzia

Naito et al [2013]

c.961G> A

p.Gly321Ser

S6 dominio transmembrana

olandese

Infanzia

Coucke et al [1999]

c.1044_1051del8

p.Ala349ProfsTer19

C-terminale citoplasmatica

giapponese

Infanzia

Wasano et al [2015]

c.2039C> T

p.Ser680Phe

C-terminale citoplasmatica

Han cinese

Infanzia

Wu ed altri [2013]

Nota sulla classificazione variante: Varianti elencate nella tabella sono stati forniti dagli autori personale GeneReviews non sono verificate in modo indipendente la classificazione delle varianti..

Nota sulla nomenclatura: GeneReviews segue le convenzioni di denominazione standard del Genome Variation società umana(www .hgvs.org). Vedere di riferimento rapido per una spiegazione di nomenclatura.

Sequenze di riferimento per KCNQ4: NM_004700 .2, NP_004691 .2

1.

Designazione Variante che non è conforme alle convenzioni di denominazione corrente

2.

Patologia era alta frequenza insufficienza uditiva e l'espressione tessuto-specifica era in cellule ciliate esterne cocleari e cervello per tutte le varianti sordità legate descritti nella tabella.

Normal prodotto genico. La proteina codificata da KCNQ4 è 695 aminoacidi in lunghezza. La proteina forma un canale del potassio che consiste di sei domini transmembrana e una regione P-loop che forma il poro canale.Un altamente conservata glicina-tirosina-glicina (GYG) Sequenza firma all'interno del P-loop comprende il filtro di selettività che fornisce la discriminazione di ioni di potassio per il trasporto selettivo [Kubisch et al 1999]. Varianti sordità correlati hanno dimostrato di raggrupparsi nella regione del poro del canale e un po 'di influenzare direttamente questo filtro di selettività (cioè, p.Gly285Ser e p.Gly285Cys).

Anormale prodotto del gene. La maggior parte delle varianti KCNQ4 sordità correlati sono alterazioni missense (Tabella 3) che causano la perdita di udito attraverso una dominante effetto -negativa. Questi alleli sono tipicamente associati con la perdita progressiva dell'udito con l'infanzia o l'esordio adolescenziale.Inizialmente, le alte frequenze sono prevalentemente colpite; più tardi nella vita, la perdita dell'udito può diventare grave a profondo su tutte le frequenze. Il fenotipo riflette la conseguenza di proteine ​​KCNQ4 difettoso nell'orecchio interno. Questa proteina assembla come tetramero a formare un canale del potassio in quattro subunità. In una persona con una variante missenso sordità legati in un unico allele, la metà della quantità totale di proteina codificata è difettoso e quindi solo uno di ogni 16 canali comprende quattro subunità proteiche normali [Kubisch ed altri 1999]. Nel corso del tempo il risultato è ipotizzato essere progressiva perdita riciclaggio potassio nell'orecchio interno. Poiché gli ioni potassio sono fondamentali per la trasduzione delle cellule dei capelli, l'impossibilità di riciclare questi ioni si traduce in perdita di udito. Queste varianti sordità correlati influenzano aminoacidi situati all'interno o in prossimità del poro del canale. La presenza di una proteina subunità anormale interferisce con il montaggio e / o la funzione della proteina canale tetramerica nell'orecchio interno. Alcune varianti-DFNA2 causando in KCNQ4 sono delezioni che si traducono inhaploinsufficiency. Come risultato, le cellule dell'orecchio interno producono insufficiente proteina KCNQ4 funzionale e nel tempo funzione uditiva è compromessa.

Prove per locus eterogeneità. I primi rapporti di GJB3 (gap junction codifica proteine ​​β-3, o connessina 31) varianti come causale della DFNA2 perdita di udito non sindromica non sono state dimostrate. Non ci sono ulteriori famiglie con DFNA2 causate da varianti GJB3 sono stati segnalati in quanto l'originale famiglie cinesi nel 1998.

GJB3 stato suggerito come la sordità associata gene al DFNA2 locus sulla base di due diverse varianti di sequenza GJB3 identificata in due piccole famiglie cinesi [Xia et al 1998]. Le persone provenienti da entrambe le famiglie avevano perdita bilaterale neurosensoriale dell'udito (SNHL), caratterizzata da un audiogramma downsloping dolcemente da normali soglie uditive sotto 1.000 Hz a una perdita dell'udito moderata nelle alte frequenze.

Tuttavia, le prove associando le varianti GJB3 con la perdita dell'udito è né sostanziale né convincente:

  • In entrambe le famiglie, altre persone con udito normale ha avuto le varianti sordità legati segnalati, una ricerca in contrasto con completa penetranza, che si osserva in quasi tutti i tipi di autosomica dominanteSNHL.
  • E 'dubbio che le varianti sordità legati KCNQ4 sono stati esclusi in queste due famiglie segnalate nel 1998, come varianti sordità legati KCNQ4 non sono stati implicati in autosomica dominante SNHL fino al 1999.
  • Non ci sono altre famiglie con autosomica dominante SNHL sono stati segnalati per separare le varianti sordità legati GJB3.
  • Varianti sordità specifici relativi a GJB3 causa erythrokeratodermia variabilis.

References

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KCNQ4, un canale di potassio espresso nelle cellule sensoriali ciliate esterne, è mutato negativamente  causando  una Sordità Dominanti

Christian Kubisch §,

Björn C Schroeder §

Thomas Friedrich, Björn Lütjohann

Aziz El-Amraoui

Sandrine Marlin,

Christine Petit,

Thomas J Jentsch ‡corrispondenzaQuesto indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo." title=""E-mail l'autore" ">e-mail

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Ricevuto in forma riveduta:30 dicembre 1998ricevute:7 dic 1998

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Introduzione

La perdita dell'udito è il difetto sensoriale ereditaria più frequente negli esseri umani. Circa 70 milioni di persone nel mondo soffrono di una perdita uditiva superiore a 55 dB (Wilson 1985). La percentuale di persone affette da perdita dell'udito aumenta notevolmente con l'età. La perdita dell'udito può essere dovuta a fattori ambientali e genetici, e la perdita progressiva degli anziani (presbiacusia) più spesso sembra essere dovuto ad una combinazione di entrambi.

Sordità ereditaria può essere classificato come non sindromica (isolato perdita di udito) o sindromica (associata ad altre anomalie).Diverse centinaia di sindromi, consistente perdita associata con difetti in una varietà di altri organi dell'udito, sono stati descritti(Gorlin et al., 1995). La sordità non sindromica è classificato secondo la sua modalità di trasmissione come DFN, DFNA, e DFNB (X-linked, autosomica dominante, e autosomica recessiva, rispettivamente). In generale, autosomica recessiva sordità ha un esordio precoce ed è molto grave. Autosomica dominante sordità, al contrario, più spesso si sviluppa lentamente nell'arco di diversi decenni.Si spera che i geni identificati in famiglie con sordità dominante può anche essere alla base di alcune forme di presbiacusia.

Un gran numero di loci per la sordità non sindromica sono stati identificati negli ultimi 4 anni. Ci sono almeno 19 loci per la sordità autosomica dominante (DFNA1 a DFNA19) e 22 loci per DFNB. A volte, a seconda della particolare mutazione, lo stesso gene può essere coinvolto nella sordità dominante o recessivo (13, 15, 40, 6, 35, 19). Diversi geni coinvolti nella sordità sindromica e non sindromica sono già stati individuati e sono rivisto in Petit 1996 e KALATZIS e Petit 1998. Tra gli altri, i loro prodotti genici includono isoforme convenzionali miosina (40, 38), connessina 26 (una proteina gap junction) (Kelsell et al., 1997), e due geni codificanti le subunità di canali del potassio, (KCNQ1 e KCNE1) (20, 28).

Canali ionici svolgono un ruolo importante nella trasduzione del segnale e nella regolazione della composizione ionica dei liquidi intra ed extracellulari. Le mutazioni in canali ionici sono stati da tempo sospettati come possibilmente sottostante alcune forme di perdita dell'udito. Nella coclea, la corrente trasduzione attraverso le cellule sensoriali è portato da potassio e dipende dalla concentrazione di ioni nel che endolymph. Finora, solo due geni che codificano per K + subunità del canale KCNQ1 e KCNE1, sono stati trovati per essere mutato in sindromica sordità ereditaria. I prodotti genici di entrambi i geni, la KCNQ1 (o KVLQT1) e il visone (ISK) o proteine, rispettivamente, formano eteromerici K + canali (1, 25). KCNQ1 è un membro tipico della K voltaggio-dipendenti + superfamiglia canale con sei domini transmembrana. La proteina minK ha una campata unica transmembrana (Takumi et al., 1988) e non possono formare K + canali di propria. Tuttavia, come β subunità si migliora e modifica le correnti mediate da KCNQ1. Questi canali heteromeric partecipano alla ripolarizzazione del potenziale d'azione cardiaco. Alcune mutazioni in uno KCNQ1 o KCNE1 causano una forma della sindrome autosomica dominante del QT lungo (LQTS) (37, 32), una malattia caratterizzata da anomalie della ripolarizzazione di potenziali d'azione cardiaci con conseguente aritmie e morte improvvisa. Altre mutazioni in entrambe gene portano alla recessivo Jervell e Lange-Nielsen (JLN) sindrome che combina LQTS con sordità congenita (20, 28). Per causare sordità, correnti KCNQ1 / minK devono essere ridotti rispetto ai livelli che sono già sufficientemente bassa per causare aritmia cardiaca.

KCNQ1 e KCNE1 mutazioni portano alla malattia cardiaca perché incidenti direttamente segnalazione elettrica. Il meccanismo alla base della sordità sindromica in JLN è diverso. Canali KCNQ1 / minK probabilmente mediano la secrezione di potassio nel endolinfa che bagna la superficie apicale delle cellule ciliate che convertono la stimolazione meccanica in segnali elettrici. Infatti, sia minK e KCNQ1 sono coexpressed nel vascularis stria che secerne endolinfa (24, 20), e questa secrezione è difettoso nei topi cancellate per il gene minK (Vetter et al., 1996).

In questo lavoro, abbiamo clonato e caratterizzato KCNQ4, un romanzo membro della famiglia KCNQ di K + canali. KCNQ4 è stato mappato il locus DFNA2, e una negativamente dominante KCNQ4 mutazione che causa la sordità in un pedigree DFNA2 è stato identificato. In contrasto KCNQ1, KCNQ4 probabilmente non contribuisce a endolinfa secrezione ma è direttamente importante per la funzione delle cellule ciliate esterne sensoriali. Inoltre, simile a KCNQ2 che forma heteromers funzionali con KCNQ3 che probabilmente alla base della corrente M (Wang et al. 1998b), KCNQ4 costituisce anche canali eteromerici con KCNQ3. Questo lavoro apre nuove prospettive per la fisiologia cocleare e per questo interessante ramo della K + Family Channel.

Risultati

Clonazione e caratterizzazione del KCNQ4 cDNA

Utilizzando un KCNQ3 K + canale parziale cDNA come sonda, una libreria di cDNA retina umana è stato proiettato e un ~ 1 kb cDNA codificante una omologa frammento proteico ai canali KCNQ è stato isolato. E 'stato distinto dal noto membri KCNQ1 (KvLQT1), KCNQ2, e KCNQ3. Abbiamo chiamato il gene romanzo KCNQ4. CDNAs sovrapposti contenenti l'intera griglia di lettura aperta stati ottenuti ricontrollare la libreria di cDNA ed estendendo l'estremità 5 'RACE (amplificazione rapida di cDNA) termina esperimenti.

Il cDNA codifica un polipeptide di 695 aminoacidi con una massa prevista di 77 kDa (Figura 1A). La sua identità globale aminoacidi a KCNQ1, KCNQ2, e KCNQ3 è del 38%, 44% e 37%, rispettivamente. Insieme a queste proteine ​​si forma un ramo distinto della superfamiglia di K voltaggio-dipendenti + canali (Figura 1B). Come un membro tipico di questa famiglia di geni, si è previsto di sei domini transmembrana e un ciclo P tra i domini transmembrana S5 e S6. In K + canali, che sono tetrameri di subunità identiche o omologhi, quattro di questi cicli P altamente conservate combinano per formare il poro ionico selettivo (Doyle et al., 1998). Come altri canali KCNQ, KCNQ4 ha una lunga previsto carbossile terminale citoplasmatica che rappresenta circa la metà della proteina. Una regione conservata presente nel carbossile termini di KCNQ1, -2, e -3 è presente anche in KCNQ4 (circa rappresentato da esone 12).La sua funzione è attualmente sconosciuto. La sequenza di KCNQ4 prevede numerosi siti potenziali per la fosforilazione di proteine ​​chinasi C. A differenza KCNQ1 e KCNQ2, tuttavia, manca un sito consenso amino-terminale per fosforilazione cAMP-dipendente. La fosforilazione di quel sito aumenta le correnti di canali KCNQ2 / KCNQ3 eteromerici (Schroeder et al., 1998). Diverse varianti di splicing sono stati descritti per KCNQ1 attraverso KCNQ3. La maggior parte di questi avvengono nel carbossile terminale citoplasmatica (ad esempio, Biervert et al., 1998). Nella regione corrispondente KCNQ4, abbiamo trovato un splice variante che mancava di esone 9, portando ad un in-frame delezione di 54 aminoacidi (residui 378 a 431). Esperimenti di PCR su cDNA adulto cervello umano hanno dimostrato che si trattava di una trascrizione di minoranza (dati non riportati). Analisi Northern dell'espressione KCNQ4 in tessuti umani ha rivelato fasce deboli di cuore, cervello e muscoli scheletrici (dati non riportati).

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Figura 1

Sequenza Confronto di canali KCNQ potassio

(A) Allineamento di KCNQ1 (KvLQT1) e KCNQ4 K + sequenze di aminoacidi canale. Residui identici sono contrassegnati da uno sfondo nero. I domini transmembrana S1 attraverso S6 e la P anello formano pori sono indicati con barre sopra la sequenza.Posizioni di introni sia KCNQ1 e KCNQ4 sono indicati da frecce, e gli esoni sono numerati per entrambi i canali. La sequenza KCNQ4 cDNA è stato depositato nel database GenBank sotto adesione # AF105202. Le sequenze di tutti gli esoni con sequenze introniche adiacenti sono disponibili sotto adesione # AF105203 - AF105216.

(B) Dendrogramma (ClustalX, parametri di default) si confrontano tutti KCNQ K noti + canali di K selezionati + canali della classe Kv. È evidente che i canali KCNQ formano un ramo distinto del K + superfamiglia canale. I suoi singoli membri sono meno correlati tra loro rispetto, ad esempio, Kv1.1 attraverso Kv1.4.

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Struttura genomica e cromosomica mappatura al DFNA2 Locus

Una PAC è stato isolato che contiene l'intero KCNQ4 regione codificante. La struttura genomica del KCNQ4 gene è stato istituito(Figura 1A e procedure sperimentali). Il blocco transmembrana S1-S6 è codificato da sei esoni (esoni 2 a 7) aventi gli stessi limiti inKCNQ2 e KCNQ3 (Schroeder et al. 1998). In KCNQ1, un introne ulteriore interrompe la sequenza di codifica dominio S4. Le strutture esone-introne del KCNQ geni divergono maggiormente capolinea carboxyl di queste proteine.

Utilizzo di ibridazione di cromosomi umani, KCNQ4 è stato mappato 1p34. Numerosi loci di malattia sono stati mappati in questa regione, tra cui DFNA2, un luogo per la perdita progressiva dell'udito dominante (Coucke et al., 1994). A causa del ruolo critico di K +omeostasi nel meccanotrasduzione uditiva, abbiamo preso in considerazione KCNQ4 un eccellente gene candidato per DFNA2. Il locus DFNA2 è stato mappato tra i marcatori D1S255 e D1S193 (5, 34). Abbiamo quindi perfezionato la localizzazione di KCNQ4rispetto al pubblicato mappe fisiche e genetiche utilizzando un YAC (lievito artificiale cromosoma) contig di questa regione (Figura 2).KCNQ4 era presente CEPH YAC clone 914c3, un risultato che colloca questo gene nel DFNA2 regione.

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Figura 2

Mappatura genomica del KCNQ4 Gene

Sinistra, carta citogenetica di una parte del braccio corto del cromosoma umano 1. I confini della regione pubblicati DFNA2 (5, 34),così come la localizzazione di KCNQ4 secondo la nostra analisi FISH, sono indicati. Center, un allargamento di questa regione con il relativo mappa Généthon (1996), compresi marcatori microsatelliti e distanze in centimorgan (Cm). A destra, il contig Whitehead WC1.10 di quella regione. Le barre sul lato destro rappresentano YACs in quella regione (nomi in scatole) che sono stati utilizzati qui. Marcatori testati sono mostrati a destra. Cerchi pieni indicano marcatori già testati in precedenza, mentre i rettangoli sono marcatori recentemente effettuate in questi YACs in questo lavoro. In contrasto con il suggerimento di Van Camp et al. 1997 che si basa su un unico ricombinante pedigree, i nostri posti di lavoro MYCL1 telomeric a D1S432. Questo concorda con il Data Base Location (LDB). La nostra mappatura mostra che KCNQ4 associa alla regione DFNA2 inequivocabile.

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L'espressione di geni KCNQ nell'orecchio interno

L'espressione di KCNQ4, nonché altri KCNQ geni, è stato studiato da RT-PCR semiquantitativa sul mouse RNA cocleare. Questi risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti con vestibolare e cervello RNA (Figura 3A). KCNQ1, KCNQ3, e KCNQ4 messaggi possono essere rilevati nella coclea, e ulteriori cicli di PCR ha rivelato un'espressione KCNQ2 debole, pure. A questa elevata amplificazione, KCNQ1 stata anche rilevata nel cervello (dati non mostrati). KCNQ1 e KCNQ4 sembrano avere la più alta espressione cocleare. Espressione KCNQ1 è maggiore nella coclea che nel cervello (che era negativo per analisi Northern [Wang et al., 1996]). Il contrario è vero per KCNQ2 e KCNQ3, entrambi i quali sono largamente espressi in cervello (Schroeder et al., 1998). KCNQ4 espressione è significativa in entrambi i tessuti.

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Figura 3

L'espressione di KCNQ4 nell'orecchio interno

(A) Espressione dei canali KCNQ nella coclea, vestibolo e cervello come rivelato mediante RT-PCR. c, RNA cocleare; v, RNA vestibolare; b, RNA cervello. Se 1/10 della quantità di cDNA è stato impiegato per l'amplificazione, questo è indicato da 1:10. Come preparazione di RNA cocleare e vestibolare è difficile, ci può essere una piccola contaminazione incrociata tra questi preparativi.

(B e C) In situ ibridazione della coclea mouse (al giorno postnatale P12) utilizzando una sonda antisenso KCNQ4 mouse o, come controllo, una sonda senso (D). Messaggio KCNQ4 è presente nelle tre celle esterne (OHC) capelli, etichettati da 1 a 3, ma non viene rilevato nella cella di capelli interna (IHC), né nella vascularis stria (SV). Cellule DC, Deiters; BM, membrana basilare; SP, prominenza spirale; SL, spirale limbus; TM, membrana tettoria. (B) è un ingrandimento maggiore di (C). La colorazione prevalentemente apicale OHC è tipico per queste cellule ed è probabilmente legato alla localizzazione del nucleo basale.

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In situ ibridazioni sono state eseguite su sezioni coclea da topi a P12 postnatale giorno con una sonda antisenso KCNQ4. Cellule ciliate esterne sensoriali sono stati fortemente etichettati (Figura 3B e Figura 3C). Al contrario, le cellule ciliate interne apparso negativo. Vascularis stria, il luogo di espressione KCNQ1 (Neyroud et al. 1997), è stata negativa e (Figura 3C). Ibridazione di controllo con una sonda senso KCNQ4 (Figura 3D) ha rivelato che la colorazione delle cellule ciliate esterne era specifico.

Un KCNQ4 Pore mutazione in un pedigree con autosomica dominante sordità

Questi risultati hanno indicato che KCNQ4 era un eccellente gene candidato per la sordità autosomica dominante. Abbiamo proiettato 45 famiglie con autosomica dominante sordità senza precedente analisi di linkage. Nella maggior parte di queste famiglie, la perdita di udito era stato diagnosticato prima dell'età adulta, cioè, prima dell'età di insorgenza segnalato per la maggior parte delle forme DFNA, compresi DFNA2. Screening delle mutazioni è stata limitata a esoni 4 a 7, che codificano la regione del poro e dominio transmembrana adiacenti. Un KCNQ4 mutazione venne trovata in una famiglia francese con sordità profonda. Le sue caratteristiche cliniche (ripresi in dettaglio procedure sperimentali) comprendono perdita progressiva dell'udito che è più importante, con frequenze più alte, l'acufene in un paziente, e nessuna indicazione per i difetti vestibolari né cambiamenti morfologici lordi nell'orecchio interno. Una mutazione missense (G285S) era presente in esone 6 in uno stato di eterozigote (Figura 4A). Si segregata con tutti i membri affetti nel pedigree (Figura 4C). Questa mutazione non venne trovata in 150 controllo cromosomi caucasici.

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Figura 4

Analisi della mutazione di KCNQ4 in un DFNA2 Pedigree

Analisi (A) Sequenza della regione dei pori di KCNQ4 in inalterata (WT / WT) e un membro affetto (WT / G285S) del pedigree. Sono mostrati stampe diretti da sequencer ABI377 automatizzato. Essi rivelano un A G-to-transizione su un allele del paziente, che porta alla mutazione missenso G285S. La mutazione porta a un sito di restrizione AluI romanzo (AGCT).

Confronto (B) Sequenza della regione P anello formano pori tra tutti i canali KCNQ pubblicati e due K di più imparentati alla lontana+ canali (hERG e Kv1.1). Gli amminoacidi identici ai residui KCNQ4 sono indicate da trattini. La mutazione G285S identificata nel pedigree (riga in basso) cambia la prima glicina del motivo altamente conservato GYG ad una serina. Questi tre residui allineano la parte più stretta del K + pori canale.

(C) Segregazione della mutazione G285S nel pedigree DFNA2. Exon 6 di KCNQ4 è stato amplificato mediante PCR da DNA genomico da tutti i membri del pedigree abbiamo avuto accesso a (senza DNA era disponibile da un nonno). Questo prodotto di PCR di 270 bp prodotti che sono stati digeriti con AluI, che è diagnostico per la mutazione G285S e risultati in frammenti di 157 e 113 bp. Poiché la mutazione è presente in uno stato eterozigote, bande WT sono presenti per ogni individuo. La mutazione cosegregates con sordità.

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La mutazione G285S influisce sulla prima glicina nella sequenza firma GYG di K + pori canale (Figura 4B). Questo glicina è altamente conservati tra le diverse classi di K + canali in tutte le specie. La struttura cristallina di Streptomyces lividans K + canale rivela che questi tre amminoacidi allineano la parte più stretta del poro (Doyle et al. 1998). Mutazioni in questi aminoacidi perturbare il filtro di selettività e nella maggior parte dei casi aboliscono funzione del canale. È interessante notare che lo stesso cambiamento di aminoacidi nella posizione equivalente è stato trovato nel KCNQ1 gene di un paziente con le LQTS dominanti (Russell et al. 1996). E 'interrotto l'attività del canale ed esercitò un effetto dominante negativo sui canali KCNQ1 WT coespressi (Wollnik et al., 1997).Queste mutazioni hanno anche effetti dominante-negativi quando inserito in KCNQ2 e KCNQ3 (Schroeder et al., 1998). Questa è una forte evidenza che la perdita progressiva dell'udito in questa famiglia è dovuta alla mutazione KCNQ4 G285S.

Espressione funzionale di canali KCNQ4 potassio

KCNQ4 era espresso in Xenopus ovociti e la sua attività è stata studiata da due elettrodi tensione di bloccaggio. Simile a KCNQ1, KCNQ2, e KCNQ3, KCNQ4 anche prodotto correnti che attivati ​​su depolarizzazione (Figura 5A). Rispetto a questi altri canali KCNQ, attivazione corrente era più lenta e si è verificato con una costante di tempo nell'ordine di 600 ms a +40 mV (canali KCNQ2 / KCNQ3 hanno una costante di tempo corrispondente ~300 ms). Questa costante di tempo è molto sensibile alla temperatura. Disattivazione delle correnti a potenziali di riposo fisiologico (~-70 mV) è stato molto più veloce (Figura 5B). Simile a KCNQ2 (Biervert et al., 1998),le correnti spesso hanno mostrato qualche correzione verso l'interno a potenziali positivi. Quando gli ovociti sono stati depolarizzati a +60 mV per 10 s o più, è stato osservato un inattivazione lenta apparente (dati non mostrati) molto simile a quello descritto per KCNQ3 (Yang et al., 1998). Correnti cominciato ad attivare a circa -40 mV, con l'attivazione di mezza massimo a -10 mV (Figura 5C).Il canale è selettiva per K (Figura 5D). Ha un K + ≈Rb + Cs + Na + sequenza di permeabilità. Correnti KCNQ4 stati inibiti di oltre l'80% da 5 mM Ba 2+ (dati non mostrati).

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Figura 5

Proprietà elettrofisiologiche delle Correnti KCNQ4

(A) a due elettrodi di tensione-clamp tracce corrente da un Xenopus ovociti iniettato con KCNQ4 cRNA. Da un potenziale di -60 mV possesso, le cellule sono state bloccate per 4 s di tensioni tra -80 a +60 mV a passi di 10 mV, seguito da un impulso costante a -30 mV.

(B) comportamento inattivazione di KCNQ4 con tensioni diverse. Dopo un impulso di tensione di attivazione (3,5 s a +40 mV), la cella è stata fissata a tensioni tra +40 a -120 mV a passi di 10 mV.

(C) apparente probabilità di apertura (p aperto) in funzione della tensione determinata dalla coda attuale analisi delle correnti come in (A). P metà-massimaleaperto viene raggiunta a -10.0 ± 1.2 mV, e la carica gating apparente è 1,4 ± 0,1, come ottenuto inserendo una funzione Boltzmann ai dati (n = 14 di due lotti di ovociti, ± SEM).

(D) Spostamento del potenziale inversione con la extracellulare K + concentrazione. Concentrazione totale cationi monovalenti era di 100 mm, K + sostituito Na +. Il potenziale spostamento inversione di 46,7 ± 0,9 mV per decennio indica un K + canale -selettivo (n = 18 da tre lotti di ovociti, ± SEM). Sostituzione di K esterna + con altri cationi ha dato i seguenti rapporti di permeabilità: P K / PNa = 52.3 ± 4.4, P K / P Cs = 7,8 ± 0,7 e P K / P Rb = 0.94 ± 0.03 (sequenza permeabilità: Rb + ≈K + Cs + Na+, n = 15 da tre lotti di ovociti, ± SEM).

(E) le tracce attuali di WT KCNQ4 (spessa linea continua), un 1: 1 co-iniezione di WT KCNQ4 e KCNQ4 G285S mutante (sottile linea continua), e KCNQ4 G285S mutante (linea tratteggiata). KCNQ4 G285S correnti erano indistinguibili da ovociti di controllo-iniezione d'acqua. Da un potenziale di -60 mV possesso, le cellule sono state bloccate per 6 s a +40 mV, seguito da un passo -30 mV.

(F) le correnti medie dopo 4 s al 40 mV, in media da diversi esperimenti come in (E) (n = 20 a 35, quattro lotti ovocita, ± SEM).

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Abbiamo poi esaminato l'effetto della mutazione G285S trovato nella famiglia interessata (Figura 5E e Figura 5F). Il canale mutante non ha dato alcun correnti rilevabili quando espresso in Xenopus oociti. KCNQ4 G285S è stato poi iniettato in un rapporto 1: 1 con WT KCNQ4 per simulare la situazione in un paziente DFNA2 eterozigote. Questo correnti ridotta di circa il 90%, indicando un forte effetto dominante negativo del mutante. I canali presenti in oociti coinjected ancora mostrato una forte preferenza di potassio su sodio o calcio (dati non mostrati). Ciò implica che la sordità è dovuto ad una perdita quantitativa di KCNQ4 K + correnti piuttosto che un afflusso di Na + o Ca 2+.

KCNQ1 assembla con minK (ISK) per formazione di canali che producono le correnti più grandi e attivano molto più lento (1, 25).Abbiamo testato per coexpression se minK colpisce KCNQ4 pure. A concentrazioni (1 ng minK cRNA per ovocita) che portano a marcati cambiamenti nelle correnti KCNQ1 in esperimenti paralleli, non vi è stato alcun cambiamento significativo nella correnti KCNQ4 (dati non riportati).

Diverse subunità KCNQ possono formare canali eteromerici. Coexpression di KCNQ2 con KCNQ3, ma non con KCNQ1, ha dato correnti che erano circa 10 volte più grandi di quelli dai canali omomerici (27, 39, 43). Dal momento che KCNQ1 e KCNQ3 (e in misura minore, KCNQ2) sono espresse anche nella coclea (figura 3A), abbiamo studiato se queste proteine ​​interagiscono funzionalmente.Ovociti coinjected (alla stessa concentrazione totale cRNA) con KCNQ1 e KCNQ4 CRNAs diedero correnti che non sembrava diverso da una sovrapposizione lineare delle correnti dai rispettivi canali omomerici (figura 6A), e lo stesso vale per gli ovociti coexpressing KCNQ2 e KCNQ4 (Figura 6B). Inoltre, un mutante dominante negativo KCNQ1 (Wollnik et al., 1997), non ha soppresso correnti KCNQ4 (Figura 6A), e questo vale anche per il mutante KCNQ2 equivalente (Schroeder et al., 1998) (Figura 6B).

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Figura 6

L'interazione funzionale di KCNQ4 con altri KCNQ Subunità

Coexpression di KCNQ4 con KCNQ1 (A), KCNQ2 (B), e KCNQ3 (C) e derivati ​​mutanti dominanti negativi (KCNQ1 G219S, KCNQ2G279S, KCNQ3 G318S) (n = 10-31, tre lotti ovocita, ± SEM).

(D) le correnti rappresentativi da esperimenti come in (C) che mostra una cinetica di attivazione alterati per la co-iniezione di KCNQ4 con KCNQ3 o KCNQ3 G318S, rispettivamente. Da un potenziale mantenimento a -60 mV, la tensione è stata fissata per 4 s a +40 mV, seguita da una fase di -30 mV. Costanti di tempo e ampiezze ottenuti da attacchi di due esponenziali erano KCNQ4: τ 1 = 360 ms, A 1 = -4.9 μ A T si 2 = 1700 ms, A 2 = -0.34 μ A; KCNQ3 + KCNQ4: τ 1 = 120 ms, A 1 = -6.3 μ A T si 2 = 560 ms, A 2 = -1.3 μ A.

(E) p apparente aperto in funzione della tensione per correnti da oociti coinjected con KCNQ4 e KCNQ3 cRNA, determinate dalla coda corrente analisi (piazze, curva continua). P mezza massima apertura è realizzata a V 0.5 = -19,1 ± 2.0 mV, e la carica gating apparente è di 1,5 ± 0,2 (n = 23 da tre lotti di ovociti, ± SEM), come ottenuto da un impeto di una funzione di Boltzmann. Il p apertocurva KCNQ4 viene mostrato come riferimento (cerchi, curva tratteggiata).

(F) tracce correnti hanno registrato da un ovocita coinjected con KCNQ3 e KCNQ4 cRNA utilizzando un tipico protocollo di tensione corrente M. Da un potenziale mantenimento a -30 mV, la cella era progressivamente iperpolarizzato per 1 s per tensioni comprese tra -30 e -90 mV a -10 mV passi.

(G) effetti differenziali di 200 μ M linopirdine su KCNQ4 (n = 10, ± SEM) e KCNQ3 + KCNQ4 (n = 6, ± SEM). Correnti sono stati misurati a +40 mV, e viene mostrato percentuale della corrente residua con linopirdine. Inibizione stato stazionario è stato raggiunto dopo ~ 1 min per correnti KCNQ4 e dopo ~3 minuti per KCNQ3 + KCNQ4 correnti.

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Al contrario, coexpression di KCNQ3 con KCNQ4 prodotto correnti che significativamente erano più grandi di potrebbe essere spiegato da una sovrapposizione di correnti dai rispettivi canali omomerici (Figura 6C e Figura 6D). Inoltre, le correnti KCNQ4 sono stati notevolmente soppressi da coexpressing un mutante KCNQ3 dominante negativo (Schroeder et al., 1998) (Figura 6C). Correnti da ovociti coinjected attivati ​​più veloce di correnti KCNQ4 (Figura 6D), e c'era un ~ 10 mV spostamento della probabilità di apertura verso tensioni negative (Figura 6E). Rispetto al KCNQ2 canali / KCNQ3, che possono essere alla base della corrente M (Wang et al.1998b), heteromers KCNQ3 / KCNQ4 aperto leggermente tensioni più positivi. Per confrontare i canali KCNQ3 / KCNQ4 ai canali M, abbiamo usato il protocollo di tensione tipico impiegato per questi canali (Wang et al. 1998b) e abbiamo trovato le correnti superficialmente simili a correnti M (Figura 6F). Linopirdine, un inibitore potente e piuttosto specifico per correnti M, inibisce quasi completamente canali KCNQ2 / KCNQ3 ad una concentrazione di 200 μ M (Wang et al. 1998b). Questa concentrazione di linopirdine inibita KCNQ4 di circa il 30%, mentre una inibizione significativamente più grande (~75%) è stata osservata con KCNQ3 / KCNQ4 coexpression (Figura 6G).

Discussione

In questo lavoro, abbiamo identificato il gene per DFNA2, un locus coinvolto in autosomica dominante sordità. Codifica KCNQ4, un canale del potassio romanzo. È espressa in diversi tessuti, compresa la coclea, dove è presente nelle cellule ciliate esterne. Il canale mutante identificato in una famiglia DFNA2 esercita un effetto dominante negativo su WT KCNQ4. È interessante notare che il meccanismo patogenetico che porta alla sordità è diverso, con mutazioni in KCNQ4 o KCNQ1.

Canali KCNQ nella malattia genetica

È notevole che le mutazioni in ogni nota KCNQ gene portano a malattie umane: mutazioni in KCNQ1 (KvLQT1) causano i autosomica LQTS dominanti (Wang et al., 1996) e, quando presenti in entrambi gli alleli, la sindrome JLN (Neyroud et al 1997. ), i cui sintomi includono sordità oltre alle aritmie cardiache. Mutazioni in entrambi KCNQ2 o KCNQ3, che formano heteromers che probabilmente rappresentano il canale M (Wang et al. 1998b), causano convulsioni benigne familiari neonatali (BFNC) (2, 3, 29). Il presente lavoro si aggiunge KCNQ4 e la autosomica dominante associata sordità a quella lista.

Dopo KCNQ1, KCNQ4 è ora il secondo canale KCNQ perdita la cui funzione di porta alla sordità. Tuttavia, ci sono differenze importanti. La perdita dell'udito causata da KCNQ1 mutazioni è sindromica, grave, e congenita, ed entrambi gli alleli del gene sono mutati. Per contro, la sordità associata KCNQ4 è nonsyndromic, progredisce lentamente, ed è dominante. La riduzione di correnti associate con dominanti negativi KCNQ1 mutazioni provoca gravi aritmie cardiache, ma non influenza la normale funzione cocleare(Wollnik et al., 1997). Al contrario, un dominante negativo KCNQ4 mutazione è sufficiente a causare la perdita progressiva dell'udito.Sorprendentemente, la mutazione trovata qui (KCNQ4 G285S) è esattamente equivalente a un KCNQ1 mutazione trovata in LQTS dominanti(Russell et al. 1996), che ha avuto un effetto dominante negativo simile (Wollnik et al. 1997). Così, nell'orecchio, una perdita di funzione moderata KCNQ1 è meglio tollerata un'analoga perdita di KCNQ4. I livelli di espressione di KCNQ2 e canali KCNQ3 sono ancora più vicino a una soglia critica nel cervello. Una leggera riduzione della corrente dovuta a mutazioni privi di effetto dominante negativo su un allele è sufficiente a causare l'epilessia neonatale (Schroeder et al., 1998). Così, i margini di sicurezza che separano gli attuali livelli normali dalla soglia che causa la malattia differiscono ampiamente tra diversi canali KCNQ e organi.

Heteromers Formata da KCNQ Subunità

I canali KCNQ descritti funzione per quanto fisiologicamente come heteromers. Associa KCNQ1 visone, e KCNQ2 e KCNQ3 formano canali eteromerici che possono essere alla base l'attuale M (Wang et al. 1998b), un importante determinante di eccitabilità neuronale che è regolato da diversi neurotrasmettitori (Marrion 1997). Pertanto, una domanda rilevante è se KCNQ4 forma canali eteromerici con una qualsiasi di queste proteine.

Abbiamo affrontato questo problema indipendentemente dalla loro colocalizzazione in vivo coexpressing queste diverse subunità del canale del potassio in Xenopus ovociti. Non ci sono stati effetti evidenti quando KCNQ4 stato coespressi visone a concentrazioni che influenzano notevolmente le correnti KCNQ1. Inoltre, l'espressione di queste proteine ​​si sovrappone né cervello, né nella coclea (ma può farlo nel cuore). minK mRNA non è stato trovato nel cervello (Chouabe et al., 1997). Nella coclea, KCNQ4 è espresso in cellule esterne dei capelli e visoni in vascularis stria (Sakagami et al. 1991).

Né abbiamo rilevato una interazione funzionale di KCNQ4 con KCNQ1 o KCNQ2. Tuttavia, è difficile escludere tale interazione coexpressing canali WT. Correnti di un ipotetico heteromer non possono differire da una sovrapposizione sufficiente di correnti mediate dai rispettivi homomultimers. Abbiamo quindi fatto ricorso a coexpressing mutanti dominanti negativi. Né KCNQ1 né KCNQ2 mutanti soppressi correnti KCNQ4, argomentando contro la formazione di heteromers. Simile a minK, KCNQ1 si esprime in particolare nel vascularis stria (Neyroud et al., 1997) e non si sovrappone con KCNQ4. I nostri esperimenti di RT-PCR suggeriscono che l'espressione KCNQ2 nella coclea è bassa. Insieme, questi esperimenti indicano che KCNQ4 non forma canali eteromerici con KCNQ1 o KCNQ2 nella coclea.

Al contrario, KCNQ4 interagisce con KCNQ3. Correnti di KCNQ3 omomerici sono molto piccole (27, 39). Coexpression di KCNQ3 con KCNQ4 marcatamente aumentato ampiezze delle correnti, ma questo aumento è stato inferiore alla stimolazione 10 volte osservato con KCNQ2 / KCNQ3 coexpression (27, 39, 43). Significativamente, KCNQ3 eteromerico / correnti KCNQ4 attivati ​​velocemente e con tensioni più negativi rispetto KCNQ4 e visualizzati una sensibilità ai farmaci diverso. Inoltre, un mutante KCNQ3 dominante negativo fortemente repressa correnti KCNQ4. Poiché KCNQ3 si esprime anche nella coclea (figura 3A), la formazione di canali / KCNQ4 KCNQ3 in cellule cigliate esterne è una possibilità che deve essere confermata localizzando KCNQ3 a queste cellule. La formazione di canali KCNQ3 / KCNQ4 cocleari non sarebbe in contraddizione con i coinvolgimenti di KCNQ3 nell'epilessia e di KCNQ4 sordità.Tutte le mutazioni identificate finora in BFNC mancano di un effetto dominante negativo (Schroeder et al., 1998). Pertanto, essi non sono tenuti a ridurre le correnti del heteromer cocleare ai livelli trovati con il presente mutazione KCNQ4. D'altra parte, l'espressione KCNQ4 in cervello può essere bassa. Così, può mancare un effetto significativo sui canali KCNQ2 / KCNQ3 che sono interessati a BFNC.

KCNQ2 / KCNQ3 canali eteromerici sono stati recentemente dimostrato di avere proprietà della fisiologicamente importante corrente M (1998b Wang et al.). Abbiamo dimostrato qui che KCNQ3 heteromers / KCNQ4 condividono alcune caratteristiche con canali M.Sarà interessante vedere se questi heteromers mediano varianti delle correnti M in alcune regioni del sistema nervoso.

Fisiopatologia della sordità a causa di KCNQ Mutazioni: endolinfa secrezione contro Capelli diretto Difetti Cellulari

Le cellule del recettore nell'organo di Corti che trasducono stimoli meccanici in segnali elettrici sono le cellule ciliate sensoriali (per una recente rassegna sulla fisiologia cocleare, vedere Nobili et al., 1998). L'output sinaptico delle cellule ciliate interne genera il segnale elettrico principale che media l'udito. La funzione delle cellule ciliate esterne è principalmente quello di regolare la coclea convertendo il loro potenziale recettore in una forza meccanica. Le membrane apicali di entrambe le cellule ciliate interne ed esterne sono immersi nel endolinfa che riempie i media scala. In contrasto con soluzione salina normale extracellulare, ha una concentrazione di potassio elevata di circa 150 mm e un potenziale positivo (+80 mV rispetto alla normale spazio extracellulare). Stimolazione meccanica della stereocilia delle cellule ciliate porta ad un afflusso di K + guidato dal grande tensione elettrica (~-150 mV) attraverso le loro membrane apicali.

Il potassio ripreso da cellule ciliate lascia queste cellule tramite la loro membrana basolaterale. Questo molto probabilmente coinvolge K + canali. K + è pensato per essere riciclato alla endolinfa tramite un sistema cellulare collegato con giunzioni (14, 30, 31). In questo modello, K + è occupato dalle cellule Deiters che si rivolgono alla base delle cellule ciliate esterne. E poi diffonde all'interno delle cellule attraverso giunzioni gap al vascularis stria. Ci è finalmente secreta nel endolinfa dalle cellule marginali del vascularis stria.

Studi fisiologici e immunocitochimiche hanno coinvolto canali KCNQ1 / visone questa secrezione. In un modello di topo con un gene minK interrotto (Vetter et al., 1996), i media scala crolla poco dopo la nascita. Nel giro di pochi giorni, le cellule ciliate degenerano.Caratteristiche morfologiche simili sono stati descritti nei pazienti con sindrome JLN (Friedmann et al. 1966). Quindi, ci sono forti prove che la profonda, la sordità presto che la malattia è dovuta a un difetto nella produzione endolinfa.

Il fatto che la corrente di cortocircuito attraverso il vascularis stria è quasi abolita nel minK topi knockout argomenta contro l'ipotesi che KCNQ4 può essere un importante percorso parallelo per la secrezione endolymph in questo epitelio. Inoltre, non abbiamo potuto rilevare le interazioni funzionali dei KCNQ4 con KCNQ1 o visone. Ciò esclude la formazione di un canale comune coinvolta nella secrezione endolymph. Infine, a differenza KCNQ1 e visone, KCNQ4 non è espressa nel vascularis stria, ma in cellule cigliate esterne.

Quale potrebbe essere la funzione di KCNQ4 nelle cellule ciliate esterne? A questo punto, possiamo solo speculare. Sembra improbabile che è coinvolto nella trasduzione del segnale primario sulla membrana apicale, come la tensione fortemente negativo attraverso questa membrana impedisce che venga aperta (al contrario, la tensione attraverso la membrana apicale delle cellule marginali del vascularis stria è nella -10 mV, consentendo K + secrezione attraverso canali KCNQ1 / minK apicali). KCNQ4 sarà più probabile contribuire al K basolaterale + conduttanza che è importante sia per la modulazione di eccitazione elettrica e per la rimozione di intracellulare K + ripreso apicalmente dal endolymph. Correnti che attivano lentamente con depolarizzazione sono stati descritti in cellule cigliate esterne (10, 17). Tuttavia, la loro farmacologia (ad esempio, la sensibilità a 4-aminopiridina) non si adatta con KCNQ4 o KCNQ3 / correnti KCNQ4 (TF e TJJ, osservazione non pubblicata). Tuttavia, l'ipotesi che KCNQ4 è coinvolta nella regolazione dell'eccitabilità delle cellule ciliate esterne è attraente. Si è indirettamente sostenuta dalla constatazione che KCNQ2 e KCNQ3 possono costituire il canale M che regola l'eccitabilità neuronale (Wang et al. 1998b).

Una vista complementare è che KCNQ4 è importante per la rimozione basolaterale di K + da cellule cigliate. Eventualmente, un K cronica + sovraccarico porta ad una lenta degenerazione di queste cellule. Questo potrebbe spiegare la perdita di udito lentamente progressiva nei pazienti DFNA2. È importante sottolineare che mutazioni in connessina 26, che dovrebbero interrompere il riciclaggio di K + al endolinfa, portare alla sordità anche (13, 6). Non ci sono informazioni morfologiche ancora su una possibile degenerazione delle cellule ciliate nei pazienti con DFNA2 o mutazioni in connessina 26.

Nella famiglia abbiamo studiato, così come nelle famiglie DFNA2 colpite precedentemente descritte (Coucke et al., 1994), alcuni individui affetti sofferto di tinnito. È interessante notare che alcune forme di questo disturbo sono stati collegati a una disfunzione delle cellule ciliate esterne (Kakehata e Santos-Sacchi 1996). I canali ionici sono buoni obiettivi per i farmaci, e K + sono già state sviluppate apri canale. KCNQ4 può essere un bersaglio interessante per la prevenzione della perdita progressiva dell'udito ed eventualmente per il trattamento di tinnito. La creazione di modelli di topi transgenici sarà necessario chiarire pienamente la fisiopatologia della KCNQ4 / DFNA2 sordità. Questi topi possono anche essere un modello valido per la condizione frequente di presbiacusia che si sviluppa lentamente nel corso di decenni.

Procedure sperimentali

Clonazione di KCNQ4 cDNA

Un essere umano retina cDNA λ libreria fagica (Clontech, # HL1132a) è stato proiettato con un parziale di clone di KCNQ3 cDNA. Un cDNA codificante un frammento di un romanzo KCNQ omologo successivamente denominato KCNQ4 stato isolato. Ricontrollare esteso verso la sequenza all'estremità 3 '. 5 'è stato clonato da 5' RACE utilizzando un kit Marathon (Clontech) con cDNA muscolo scheletrico umano. Un cDNA completo è stato assemblato e clonato in siti NcoI e XhoI del PTLN espressione ovocita vettore (Lorenzet al., 1996). Ciò fornisce una sequenza ottimale Kozak in agosto iniziatore e β Xenopus -globin sequenze tradotte per aumentare l'espressione in ovociti. Le mutazioni sono stati introdotti da ricombinante PCR usando Pfu polimerasi. Frammenti PCR-derivati ​​sono stati completamente sequenziati.

RT-PCR Analisi del mouse KCNQ mRNA Expression

Circa 2 μ g di topo RNA cerebrale totale e mouse cocleare e vestibolare RNA sono stati trascrizione inversa utilizzando SuperScript II (GIBCO-BRL) trascrittasi inversa. Il cDNA è stato amplificato per 30 cicli (96 ° C per 30 s, 61 ° C per 30 s, e 68 ° C per 45 s) utilizzando un termociclatore Sistema 2400 (Perkin Elmer). Ogni 50 μ reazione l conteneva 2,5 U polimerasi (Expand lungo Template PCR, Boehringer Mannheim) e il 5% DMSO. Primer KCNQ1 erano basati sulla sequenza del mouse cDNA (GenBank # U70068): 5'-aaggctggatcagtccattgg MK1a-3 'e 5'-aggtgggcaggctgttgctgg MK1r-3' (280 bp). Poiché nessuna sequenza di mouse KCNQ2 era disponibile, abbiamo scelto sequenze conservate tra umano (Y15065) e nel ratto (AF087453) KCNQ2: MK2a 5'-gccacggcacctcccccgtgg-3 'e MK2R 5'-ccctctgcaatgtagggcctgac-3' (331 bp). Primer KCNQ3 sono stati ricavati da un topo EST (AA386747): MK3a 5'-ccaaggaatgaaccatatgtagcc-3 'e 5'-cagaagagtcaagatgggcaggac MK3r-3' (461 bp). Primer mouse KCNQ4 erano MK4a 5'-agtacctgatggagcgccctctcg-3 'e 5'-tcatccaccgtaagctcacactgg MK4r-3' (366 bp). Prodotti di amplificazione sono stati verificati dal sequenziamento diretto.

Ibridazione in situ di mouse Cochlea

Un mouse KCNQ4 cDNA corrispondente a BP 618-1602 del KCNQ4 umana ORF è stato clonato in pBluescript. Senso e antisenso sonde sono state trascritte con T3 e T7 RNA polimerasi dopo opportuna linearizzazione. Dopo DNase digestione, le sonde erano etanolo precipitato per due volte con 0,4 M LiCl. Essi sono stati etichettati con digossigenina-11-UTP come descritto (Schaeren-Wiemers e Gerfin-Moser 1993). Orecchio interno mouse sono stati fissati per 1 ora a 4 ° C in paraformaldeide al 4% in PBS. Dopo tre lavaggi in PBS, sono stati immersi in 20% di saccarosio overnight a 4 ° C. Sezioni al criostato (10-14 μ m) sono stati postfissati e sciacquati in PBS. Dopo prehybridization a temperatura ambiente per ≥3 ore, sono stati ibridizzati notte a 58 ° C in una camera umida. Le sezioni sono state poi lavate e incubate con anticorpo ovino antidigoxigenin accoppiato a fosfatasi alcalina. Colorazione da NBT / BCIP (Boehringer Mannheim) è stata condotta per 2 ore a 37 ° C e notte a temperatura ambiente. Le sezioni sono state poi montate in Aquatex (Merck, USA).

Struttura genomica e amplificazione di KCNQ4 esoni da DNA genomico

La struttura genomica è stato istituito con un approccio di PCR da DNA genomico. Sequenze di esoni e introni adiacenti sono stati depositati in GenBank (numeri di accesso AF105203 - AF105216). I singoli esoni KCNQ4 e brevi sequenze introniche adiacenti sono stati amplificati mediante PCR da DNA genomico umano utilizzando primer oligonucleotidi intronici. La sequenza di questi primer e le corrispondenti protocolli di PCR può essere ottenuta presso gli autori. Per lo screening pedigree non collegate con autosomica dominante sordità, abbiamo amplificato solo esoni 4 a 7. Dopo l'amplificazione e purificazione gel, prodotti di PCR sono stati sequenziati direttamente utilizzando i primer di amplificazione e di un sequenziatore di DNA ABI377-automatizzato.

Localizzazione cromosomica di KCNQ4

Una PAC che contiene la sequenza codificante di KCNQ4 è stato isolato usando intronic primer KCNQ4 oligonucleotidi e PCR. E 'stato utilizzato per localizzare KCNQ4 a 1p34 utilizzando FISH (Genome Systems). KCNQ4 è stato poi mappato sul Whitehead Contig WC1.10 utilizzando diversi dei primer intronici sopra riportati e pubblicati STS marcatori mediante PCR da singoli cloni YAC.

Famiglia DFNA2-interessato

La famiglia con autosomica dominante, sordità progressiva (Figura 4C) è di origine francese. Nella prima generazione, la sordità è stata rilevata nella prima infanzia, nella seconda generazione intorno alla pubertà, e nella terza generazione nella prima infanzia.L'individuo terza generazione è stato lamentano acufeni da quando aveva circa 3 anni. La sordità è più grave nella terza generazione rispetto al secondo, che è ancora più grave rispetto al primo. In tutti e tre gli individui, la perdita dell'udito è più grave in alte frequenze. La perdita dell'udito è tra 50 e 90 dB a 500 Hz e tra 90 e 120 dB a 2 e 4 kHz. La seconda generazione individuo ha iniziato a camminare, quando circa 10 mesi, e tutti gli individui affetti non si lamentano problemi di equilibrio. Pertanto, non vi è alcuna indicazione per un coinvolgimento vestibolare. Non ci sono stati suggerimenti per un difetto morfogenetica alla TC.

Espressione in Xenopus laevis Ovociti e voltage-clamp studi

Dopo linearizzazione del-KCNQ4 contenente PTLN vettore con Hpal, cRNA ricoperto è stato trascritto in vitro utilizzando il kit mMessage mMachine (Ambion). Di solito 5-15 ng di cRNA è stato iniettato in Xenopus oociti precedentemente isolati da defolliculation manuale e trattamento collagenasi breve. In esperimenti di coespressione, CRNAs erano generalmente iniettati in un rapporto 1: 1. Gli oociti sono stati mantenuti a 17 ° C in soluzione modificata di Barth (90 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,41 mM CaCl2, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 0.82 MgSO mM 4, HEPES 10 mM, 100 U di penicillina-100 μ g streptomicina / ml [pH 7,6]). Due elettrodi misure di tensione-clamp sono state eseguite a temperatura ambiente 2-4 giorni dopo l'iniezione con un amplificatore Turbotec 05 (strumenti NPI) e software pClamp 5.5 (Axon Instruments). Correnti erano solitamente registrati in ND98 soluzione (vedi tabella 1). Soluzioni per Na + / K + esperimenti di sostituzione sono stati preparati da opportune miscele di soluzione KD100 e DN100. Linopirdine (RBI, Natick, MA) è stato preparato come una soluzione madre di 100 mM in DMSO e aggiunto ad una concentrazione finale di 200 μ M per ND98.Potenziali di inversione sono stati determinati dalle correnti di coda dopo 2 s depolarizzanti impulso a +60 mV e corretti per i potenziali giunzione liquido. Gli indici di permeabilità sono stati calcolati in base al P K / P X = exp (-F · V giri / R · T). Per determinare la dipendenza della tensione apparente probabilità di apertura, oociti sono stati bloccati per 4 s su valori compresi tra -80 e +50 mV mV a passi di 10 mV, seguito da un impulso di prova costante -30 mV. Correnti Tail estrapolati a t = 0 sono stati ottenuti da attacchi monoesponenziali, normalizzati per il valore a 0 mV, e utilizzati per determinare apparente p aperto. L'analisi dei dati utilizzati pClamp6 e Microcal Origin 5.0.

‡ A chi corrispondenza deve essere indirizzata (e-mail: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.).

§ Questi autori hanno contribuito anche a questo lavoro.

Tabella 1CONTENUTO Soluzione (concentrazioni in mm)

ND98

DN100

KD100

RB100

CS100

98 NaCl

100 NaCl

100 KCl

100 rbcL

100 CsCl

2 KCl

0.2 CaCl 2

0.2 CaCl 2

0.2 CaCl 2

0.2 CaCl 2

0.2 CaCl 2

2.8 MgCl 2

2.8 MgCl 2

2.8 MgCl 2

2.8 MgCl 2

2.8 MgCl 2

Soluzione tampone era 5 mM HEPES (pH 7,4).

Ringraziamenti

Ringraziamo Jacqueline Levilliers per il suo aiuto nella creazione della collezione DNA da pazienti e le famiglie per la loro collaborazione. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Association Française contre les Myopathies e la Comunità economica europea (BMH4-CT-96) per CP e la Deutsche Forschungsgemeinschaft e il Fonds der Chemischen Industrie a TJJ

References

Authors

Title

Source

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Further reading

The KCNQ4 cDNA sequence has been deposited in the GenBank database under accession number AF105202. Exons and intronic sequences have been deposited under accession numbers AF105203AF105204AF105205AF105206AF105207AF105208AF105209AF105210AF105211AF105212,AF105213AF105214AF105215AF105216.

Received: December 7, 1998; Received in revised form: December 30, 1998;

© 1999 Cell Press. Published by Elsevier Inc

Otosclerosi

La Sordità’ da Rumore