Gene POU3F4 , (DFN3) POU DOMINIO, CLASSE 3, FATTORE DI TRASCRIZIONE 4;POU3F4

HGNC Approvato genica Simbolo: POU3F4

Posizione citogenetica: Xq21.1     coordinate genomiche (GRCh38): X: 83,508,260-83,509,766 (da NCBI)

Rapporti Gene-fenotipo

Posizione Fenotipo Fenotipo  MIM Ereditarietà (in corso) Fenotipo  chiave mappatura Xq21.1 Sordità, X-linked 2 304.400 XLR 3

Qual è il nome ufficiale del gene POU3F4?

Il nome ufficiale di questo gene è "classe POU 3 homeobox 4."

POU3F4 è il simbolo ufficiale del gene. Il gene POU3F4 è conosciuto anche con altri nomi, elencati di seguito.

Per saperne di più sui nomi geni e simboli sulla About pagina.

Descrizione

Il gene codifica per POU3F4 un fattore di trascrizione che limita il potenziale di proliferazione e della famiglia di cellule staminali neurali (riassunto da Choi et al., 2013). responsabile della morfogenesi, la cui mutazione causa una rara forma con modalità di trasmissione X-linked, DFN3. Tale sordità è di tipo misto, con una quota trasmissiva rilevante (gap via aerea-osseo 50-60 dB). La forma di ipoacusia non sindromica DF’N3 è caratterizzata dalla presenza di una forma mista di ipoacusia con modalità di trasmissione legata al cromosoma X e localizzata sul cromosoma Xq21.1. La perdita uditiva è caratterizzata sia dalla presenza di una componente trasmissiva, risultante dalla fissazione della staffa, sia da un progressivo deficit neurosensoriale. Talvolta una perdita uditiva neurosensoriale profonda può mascherare la componente trasmissiva (191). A un esame radiografico con TAC si riscontrano frequentemente una dilatazione anormale dell’estremità laterale del meato uditivo interno oppure una comunicazione più ampia del normale tra il canale acustico interno e l’orecchio interno dovute a un difetto osseo o all’assenza dell’estremità laterale del meato interno o della parete della curva basale della coclea. Come conseguenza, c’è una comunicazione tra lo spazio subaracnoideo nel meato uditivo interno e la perilinfa nella coclea, che comporta un’accresciuta pressione perilinfatica. Si ritiene che questa pressione aumentata sia alla base del fenomeno di “gusher” e porterà a una cofosi, che si osserva durante interventi sulla staffa a cui talvolta questi pazienti sono sottoposti a causa della presentazione clinica dell’ipoacusia che assomiglia a quella dell’otosclerosi.

Nelle donne portatrici della mutazione le manifestazioni cliniche sono presenti in forma più lieve sia nell’aspetto malformativo che nella perdita uditiva (53, 192).

Douville e colI. identificarono un gene nel ratto, RHS2, omologo del gene umano POU3F4, che viene espresso durante lo sviluppo embrionale nel cervello, nel tubo neurale e nella vescicola otica e che mappa nel locus omologo. Perciò, sia per la sua posizione cromosomica che per la modalità di espressione temporale e spaziale nella prima embriogenesi della coclea, il gene POU3F4 è stato considerato un buon gene candidato per la sordità mista legata al cromosoma X con “gusher” perilinfatico. In alcuni pazienti con questo tipo di sordità, è stata identificata una mutazione puntiforme in questo gene e in un individuo in cui una sordità neurosensoriale profonda mascherava l’elemento portante di DFN3, è stata trovata una mutazione nonsense (192).

Inaspettatamente, è stato anche trovato che tre microdelezioni su Xq21.l e una duplicazione che erano state precedentemente identificate in pazienti con DFN3 non comprendevano il gene POU3F4. In tutti questi casi, il riarrangiamento del DNA cromosomico era localizzato prossimalmente a POU3F4, con una distanza fisica variabile tra 15 e 400 kb. In nessuno di questi pazienti, né in altri due che presentavano o un “gusher” perilinfatico durante un intervento chirurgico alla staffa o con un’anomalia all’osso temporale, sono state trovate le mutazioni puntiformi nel gene POU3F4. De Kok e colI, hanno concluso che questi casi possono essere causati da mutazioni che coinvolgono sequenze di regolazione o non codificanti. In alternativa queste anomalie potrebbero coinvolgere la struttura grossolana del cromosoma e perciò influenzare l’espressione di POLT3F4. Una spiegazione, meno probabile, potrebbe essere che altri geni in Xq21.i possano causare DFN3 (192). Riconoscere questa forma è importante, perché un tentativo di oto chirurgia per ovviare al disordine trasmissivo può facilmente portare ad una fuoriuscita massiva di endolinfa dalla finestra ovale, ed ad una conseguente anacusia. In queste forme le immagini delle rocche petrose GO) mostrano un’ampia dilatazione del condotto uditivo interno, una dilatazione del labirinto cocleo-vestibolare, ed una marcata riduzione della sepimentazione ossea cocleare fino alla scomparsa del modiolo.

 

53 Phelps, P. D., Reardon, W., Pembrey, M., Bellman, S., Luxom, L. X-linked deafness, stapes gushers and a distinctive defect of the inner ear. Neuroradiology 33: 326-330, 1991.[PubMed: 1922747, related citations]

191 Bitner-Glindzicz, M., Turnpenny, P., Hoglund, P., Kaariainen, H., Sankila, E.-M., van der Maarel, S. M., de Kok, Y. J. M., Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M., Pembrey, M., Malcolm, S.Further mutations in brain 4 (POU3F4) clarify the phenotype in the X-linked deafness, DFN3. Hum. Molec. Genet. 4: 1467-1469, 1995. [PubMed: 7581392, related citations] [Full Text]

192 de Kok, Y. J. M., van der Maarel, S. M., Bitner-Glindzicz, M., Huber, I., Monaco, A. P., Malcolm, S., Pembrey, M. E., Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M. Association between X-linked mixed deafness and mutations in the POU domain gene POU3F4. Science 267: 685-688, 1995. [PubMed: 7839145, related citations] [Full Text]

 

Clonazione ed espressione

De Kok et al. (1995) utilizzati primer PCR complementari alle sequenze di geni murini per amplificare un frammento POU3F4 umana da DNA cosmide, che è stato poi utilizzato come sonda per lo screening di una libreria cDNA del cervello fetale umano. Hanno isolato 1.4 kb di sequenza POU3F4 cDNA umano, che conteneva la completa regione codificante la proteina 1.083 bp. Le proteine ​​ratti e topi sono completamente identici, e la proteina umana contiene solo 4 sostituzioni di amminoacidi conservative. Douville et al. (1994) hanno dimostrato che l'omologo murino di POU3F4, chiamato Y2, è espresso durante lo sviluppo embrionale nel cervello, il tubo neurale, e la vescicola otica a 15,5 e 17,5 giorni dopo il concepimento. 

Qual è la funzione normale del gene POU3F4?

Il gene POU3F4 fornisce istruzioni per fare una proteina che aiuta a regolare l'attività di altri geni. Sulla base di questo ruolo, la proteina è chiamato un fattore di trascrizione. Il gene POU3F4 è parte di una grande famiglia di geni chiamati geni dominio POU, tutte producono fattori di trascrizione. Geni dominio POU giocano un ruolo nel determinare i tipi di cellule del sistema nervoso centrale durante lo sviluppo precoce. Ogni proteina della famiglia dominio POU ha due regioni, chiamato dominio specifico-POU e POU homeodomain, che si legano al DNA di altri geni.

Il gene POU3F4 rischia di essere coinvolti nello sviluppo dell'orecchio medio e interno, ed è attiva anche in alcune regioni del cervello prima della nascita. I ricercatori non hanno determinato quali geni sono regolati dalla proteina POU3F4.

 

Mappatura

Douville et al. (1994) dimostrarono che il gene del mouse per Brain-4 (POU3F4), che codifica per un fattore di trascrizione, mappe tra il locus della proteina proteolipid Plp (300401) e il marcatore DXMit6 vicino alla fosfoglicerato chinasi-1 locus (PGK1; 311800). La regione cromosomica tra PGK1 e Plp è evolutivamente conservata tra gli esseri umani e topi, che ha suggerito che il gene POU3F4 umano si trova nell'intervallo Xq13-q22. Douville et al. (1994)hanno suggerito che sia la sua posizione mappata e il suo temporale / spaziale pattern di espressione in embriogenesi presto reso POU3F4 un gene candidato per il locus DFN3 (DFNX2; 304.400). Per confermare e perfezionare la localizzazione del gene umano, de Kok et al . (1995) amplificato un frammento di gene POU3F4 genomica murina mediante PCR e ibridati a Southern blots contenenti DNA EcoRI digerito da pazienti con delezioni Xq21.Ibridazione è stato visto nel controllo maschile ma non nei pazienti DFN3 che portavano le eliminazioni di dimensione variabile in Xq21. Con l'ibridare le sonde a cosmidi da un contig che attraversava il locus DFN3, hanno localizzato il gene POU3F4 20 kb distale DXS995. 

Genetica molecolare

In 4 su 6 pazienti con X-linked sordità mista (vedi DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1995)dimostrarono una mutazione puntiforme; in un quinto dei pazienti, nei quali sordità profonda neurosensoriale mascherato l'elemento conduttore di DFN3, una mutazione nonsense è stata trovata (300.039,0001 - 300039,0,005 mila). Inaspettatamente, de Kok et al. (1995) trovarono che 3 Xq21 microdelezioni e 1 duplicazione che erano state identificate in precedenza in pazienti con DFN3 non comprendono il gene POU3F4. In tutti i 4 istanze, il riassetto si trovava prossimale e 5-prime al POU3F4, con distanze fisiche che variano tra 15 e 400 kb. In nessuno di questi pazienti, né altri 2 sia con un pozzo petrolifero perilinfatici durante chirurgia della staffa o un difetto osseo temporale, sono stati rilevati mutazioni puntiformi nel gene POU3F4. De Kok et al. (1995) conclusero che questi casi possono essere causati da mutazioni che colpiscono non codificante 5-prime o sequenze regolatrici. In alternativa, queste aberrazioni possono influenzare la struttura cromosomica lordo e quindi influenzare l'espressione di POU3F4. A meno probabile spiegazione potrebbe essere la presenza di altri geni in Xq21.1 che può causare DFN3. Bitner-Glindzicz et al. (1995) descrissero mutazioni specifiche nel gene POU3F4 in 2 famiglie con sordità legata al cromosoma X e ha suggerito che l'esperienza chiarisce ulteriormente il fenotipo di DFN3. Essi hanno concluso che DFN3 è caratterizzata non da sordità conduttiva e neurosensoriale misti associati al pozzo petrolifero perilinfatico a chirurgia della staffa, ma da una profonda sordità neurosensoriale, con o senza un componente conduttivo associato ad una anomalia di sviluppo unico dell'orecchio. La loro famiglia 1 consisteva di una madre e 2 figli di origine finlandese. Il probando avevano perdita di udito mista di 40-50 dB e suo fratello una perdita di 75-95 dB. Il primo fratello è stato trovato per avere un pozzo petrolifero perilinfatica al momento della stapedectomia. Sequenziamento del prodotto di PCR / SSCP rivelato una delezione di 4 bp nelle basi 862-866 del loro clone, situato nel homeodomain del gene POU3F4 (600420,0006). Famiglia 2 era una famiglia britannica di 3 maschi affetti. Tutti i maschi affetti avevano profonde sordità neurosensoriale diagnosticata durante l'infanzia, senza suggerimento di un componente conduttivo. Anche se 2 erano di intelligenza normale, 1 aveva un moderatamente grave difficoltà di apprendimento di causa sconosciuta. Su TAC alta risoluzione della coclea eseguito in 1 dei maschi, è stata trovata la carenza caratteristica osso tra il giro basale della coclea ed il meato uditivo interno. In studi di 4 generazioni di una famiglia, l'origine della mutazione in una nonna eterozigote potrebbe essere identificato, la mutazione essendo una transizione C-T al nucleotide 935 risultante in un alanina a valina sostituzione in un residuo altamente conservato della homeodomain della proteina predetto (600420,0007). Da osservazioni DFN3 in associazione con un complesso di duplicazione / inversione paracentric, de Kok et al. (1995)hanno concluso che esiste un elemento regolatorio situato almeno 400 kb a monte del gene POU3F4 e che questo è stato scollegato dal gene POU3F4 dall'inversione. Il lavoro di de Kok et al. (1995) e di Bitner-Glindzicz et al. (1995) ha indicato che sia sordità neurosensoriale misto e puro può essere causata da mutazioni nel gene POU3F4 e che condividono la stessa fenotipo radiologica come descritto da Phelps et al. (1991). Friedman et al. (1997) trovarono una nuova mutazione nel gene POU3F4 in 2 su 5 pazienti con collegata a X sordità mista studiati. Anche se le storie cliniche e anomalie radiografiche erano caratteristiche negli altri 3 pazienti, no mutazione è stata identificata. In 3 pazienti non imparentati con deiscenza del canale semicircolare e senza storia familiare della malattia o della sordità, Crovetto et al. (2012)mutazioni esclusi nel esone codificante del gene POU3F4. In 6 famiglie coreane con sordità legata al cromosoma X, Choi et al. (2013) ha individuato 6 mutazioni patogene POU3F4, di cui 5 nuove mutazioni (vedi, ad esempio, {} e 300.039,00010 300039,0011). C'erano 2 mutazioni missenso, 2 troncante mutazioni, e 2 mutazioni che causano l'estensione della proteina nella regione 3-prime untranslated al di fuori dei domini POU e NLS. Tutte le mutazioni producevano in attività trascrizionale diminuito di POU3F4 in studi di espressione cellulari. Le mutazioni di estensione sono stati localizzati nel citoplasma e sottoposti degradazione del proteasoma a causa di alterazioni strutturali. Una delle mutazioni frameshift portato a bassi livelli di proteine ​​che potrebbero essere ripristinati da un inibitore del proteasoma, anche se l'attività trascrizionale Impossibile ripristinare a livelli biologicamente significativi. 

Modello animale

DFN3 (DFNX2, 304.400), una non sindromica sordità mista cromosoma X-linked, è causata da mutazioni nel gene BRN4, che codifica per un fattore di trascrizione POU. Minowa et al. (1999)ha creato topi Brn4-deficienti. Avevano sordità profonda. Nessuna modifica lordi morfologiche sono stati osservati in ossicini conduttivi o coclea, anche se c'era una drastica riduzione del potenziale endocochlear. La microscopia elettronica ha rivelato gravi alterazioni ultrastrutturali cocleari fibrociti legamento spirale. Questi risultati hanno suggerito che queste fibrociti, che sono mesenchimali di origine e per i quali un ruolo nella ione potassio omeostasi 'stato ipotizzato, possono svolgere un ruolo critico nella funzione uditiva. Il fenotipo del topo mutante' legato al sesso agitarsi '(SLF) è causata da malformazioni dello sviluppo dell'orecchio interno che si traduce in perdita e disfunzione vestibolare udito. Esperimenti di mappatura pilota hanno suggerito che il gene del mouse Brn4 (omologo umano, POU3F4) cosegregate con il locus SLF sul mouse cromosoma X.. Phippard et al. (2000) identificarono la natura della mutazione SLF: una inversione cromosomica X con 1 breakpoint vicino a Brn4. Questa inversione elimina selettivamente espressione del gene Brn4 nell'orecchio interno sviluppo, ma non nel tubo neurale. Phippard et al. (2000) suggeriva che la mutazione SLF è un buon modello di topo per la forma più diffusa di X-linked sordità congenita nell'uomo, che è associata a mutazioni del ortologo Brn4 umano, POU3F4. 

VARIANTI ALLELICHE (11 Esempi selezionati):

Table View          ClinVar

.0001 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, LEU298TER [dbSNP: rs267606974] [ClinVar]

In un paziente con collegata a X sordità mista (DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1995) trovarono una mutazione nonsense leu298-to-ter. Paziente 3055 portava una delezione di un A nucleotide alla posizione 895.

.0002 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, ASP215TER [dbSNP: rs267606975] [ClinVar]

In paziente 3105 con X-linked sordità mista (DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1995) trovarono una delezione di 1 guanina che fa parte di un GGGG tetranucleotide tratto in posizioni 648 a 651, con conseguente conversione di asp215 di un codone di stop.

0,0003 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, LYS202TER [dbSNP: rs104894920] [ClinVar]

In una famiglia studiato in precedenza da Reardon et al. (1991), de Kok et al. (1995) trovarono delezione di un tetranucleotide CAAA che è presente in tandem in posizioni 603 a 610 della sequenza di tipo selvatico POU3F4. Sono stati in grado di dimostrare che la mutazione cosegregate con il fenotipo DFN3 a tutta la famiglia. Il fenotipo in questa famiglia è stato dominato da una profonda sordità neurosensoriale che mascherava l'elemento conduttore solito visto con DFN3 (DFNX2; 304.400).

0,0004 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, LEU317TRP [dbSNP: rs104894921] [ClinVar]

In paziente 5736 con X-linked sordità mista (DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1995) trovarono una mutazione leu317-to-trp nel gene POU3F4. Il residuo leucina alla posizione 317 si trova tra eliche 2 e 3 della homeodomain POE, come si deduce dalla risonanza magnetica nucleare e studi cristallografici.

.0005 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, LYS334GLU [dbSNP: rs104894922] [ClinVar]

In una famiglia con collegata a X sordità mista (DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1995)trovarono una sostituzione K334E non conservativo nel homeodomain POU della proteina POU3F4.

0,0006 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, 4-BP DEL [dbSNP: rs730882189] [ClinVar]

In 2 fratelli con perdita dell'udito e misto istituito pozzo petrolifero perilinfatica (DFNX2;304.400) in 1 e nella loro madre asintomatica, Bitner-Glindzicz et al. (1995) dimostrarono una delezione di 4 bp nelle basi 862-866 di loro clone situato nel homeodomain che ha portato in un frameshift.

0,0007 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, 935c-T, ALA-VAL [dbSNP: rs387906502] [ClinVar]

In una famiglia britannica in cui 2 fratelli e il loro zio materno avevano profonde sordità neurosensoriale 'diagnosticata durante l'infanzia, senza suggerimento di un componente conduttivo' (DFNX2; 304.400) e nel asintomatica nonna materna, Bitner-Glindzicz et al. (1995)identificarono una transizione C-T al nucleotide 935 del gene POU3F4 risultante in un alanina a valina sostituzione in un residuo altamente conservato della homeodomain della proteina prevista.

0,0008 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, ARG330SER [dbSNP: rs104894923] [ClinVar]

In un paziente con collegata a X sordità mista (DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1997) trovarono una mutazione nel gene POU3F4 prevedeva to risultato in una sostituzione aminoacidica arg330-to-ser.

0,0009 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, ARG323GLY [dbSNP: rs104894924] [ClinVar]

In un paziente con collegata a X sordità mista (DFNX2, 304.400), de Kok et al. (1997) trovarono somatica mosaicismo per una sostituzione dell'acido arg323-to-gli aminoacidi nel gene POU3F4. Il mosaicismo è stato rilevato in 2 stabiliti indipendentemente EBV immortalato cellule B e linfociti del sangue periferico (PBL). Analisi semiquantitativa ha mostrato che circa il 50% delle PBLs di questo paziente portava la mutazione. La mutazione arg323-to-Gly sembra essere avvenuto molto presto embriogenesi, prima della differenziazione delle cellule coinvolte nella ematopoiesi e sviluppo dell'orecchio interno. La mutazione era situato nella homeodomain POU ed è stato previsto di interrompere il legame della proteina POU3F4 DNA.Tutte le mutazioni puntiformi descritte precedentemente erano stati trovati nei settori POE di POU3F4.

0,0010 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, 1-BP DEL, 1069A [dbSNP: rs398122517] [ClinVar]

In 2 fratelli affetti di una famiglia coreana segreganti X-linked sordità mista (DFNX2, 304400),Choi et al. (2013) identificarono una delezione di 1 bp (1069delA) nel gene POU3F4, risultante in un frameshift ed estensione della proteina tradotta nella regione 3-prime untranslated (Thr354GlnfsTer115). La mutazione non venne trovata in 100 controlli o in un grande database di sequenze exome. Transfection della mutazione in cellule HEK293 determinato normali livelli di trascritto mutante, ma la diminuzione dei livelli di proteina rispetto ai controlli, suggerendo che la mutazione altera stabilità proteica. La proteina mutante anche mostrato localizzazione intracellulare anormale, con la maggior parte della proteina localizzata nel citoplasma e non nel nucleo. La proteina mutante mostrava diminuita attività trascrizionale rispetto al tipo selvatico. Choi et al. (2013) conclusero che questo frameshift mutazione estensione limitata accessibilità della proteina mutante di cis-acting sequenze regolatrici di POU3F4 geni bersaglio.

0,0011 SORDITA ', X-linked 2

POU3F4, 1-BP DUP, 950T [dbSNP: rs398122516] [ClinVar]

In una probando coreano e lo zio materno con sordità legata al cromosoma X (DFNX2,304.400), Choi et al. (2013) ha individuato una duplicazione di 1 bp (950dupT) nel gene POU3F4, risultante in un frameshift e premature terminazione (Leu317PhefsTer12) del C-terminale di 44 residui che attraversano il dominio POU e la NLS. La mutazione non venne trovata in 100 controlli o in un grande database di sequenze exome. Transfection della mutazione in cellule HEK293 determinato normali livelli di trascritto mutante, ma la diminuzione dei livelli di proteina rispetto ai controlli. La proteina mutante sia localizzata nel nucleo e citoplasma. Il trattamento con un inibitore del proteasoma (MG132) ha determinato un aumento dei livelli di proteina e un piccolo aumento dell'attività trascrizionale, ma non restauro livelli di tipo selvatico.

 

 

Fa le POU3F4 gene caratteristiche condividere con gli altri geni?

Il gene POU3F4 appartiene ad una famiglia di geni chiamati homeobox (homeoboxes).

Una famiglia genica è un gruppo di geni che condividono caratteristiche importanti. Classificare singoli geni in famiglie aiuta i ricercatori descrivono come i geni sono legati gli uni agli altri. Per ulteriori informazioni, vedere Quali sono famiglie di geni? Nel manuale.

Come sono i cambiamenti nel gene POU3F4 relativi alle condizioni di salute?

Sordità sindromica - causata da mutazioni nel gene POU3F4

Le mutazioni dentro o vicino alla causa gene POU3F4 una forma di sordità non sindromica (perdita di udito senza segni e sintomi correlati che interessano altre parti del corpo) chiamato DFN3. Questa forma di perdita di udito di solito comporta anomalie sia l'orecchio interno e medio (perdita uditiva mista). Le persone che hanno chirurgia per questa forma di sordità sono ad alto rischio di una complicazione chiamata pozzo petrolifero perilinfatica. Questa complicazione provoca una perdita di fluido dall'orecchio interno che può provocare gravi vertigini e una perdita totale dell'udito.

Sono state identificate più di 15 mutazioni POU3F4.  La maggior parte di questi cambiamenti genetici alterare blocchi singoli proteine ​​(aminoacidi) nella proteina POU3F4 o eliminare una piccola quantità di materiale genetico del gene.Le mutazioni impediscono alle cellule di produrre qualsiasi proteina POU3F4 o alterare regioni della proteina che sono fondamentali per il legame al DNA. La mancanza di proteine ​​POU3F4 funzionale sconvolge probabilmente il normale sviluppo delle strutture dell'orecchio medio e interno, con conseguente perdita dell'udito.

In alcuni casi di DFN3, mutazioni sono stati trovati in una sezione del DNA vicino al genePOU3F4. I ricercatori ritengono che questa regione possa avere un ruolo nella regolazione del gene POU3F4.

Dove si trova il gene POU3F4?

Citogenetica Località: Xq21.1

Posizione molecolare sul cromosoma X: coppie di basi 83.508.261 a 83.509.767

(Homo sapiens Annotazione di uscita 107, GRCh38.p2) (NCBI  )

Il gene POU3F4 si trova sul lungo (q) braccio del cromosoma X nella posizione 21.1.

Più precisamente, il gene POU3F4 si trova dalla coppia di basi 83.508.261 a 83.509.767 coppia di basi sul cromosoma X.

REFERENCES

1. Bitner-Glindzicz, M., Turnpenny, P., Hoglund, P., Kaariainen, H., Sankila, E.-M., van der Maarel, S. M., de Kok, Y. J. M., Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M., Pembrey, M., Malcolm, S.Further mutations in brain 4 (POU3F4) clarify the phenotype in the X-linked deafness, DFN3. Hum. Molec. Genet. 4: 1467-1469, 1995. [PubMed: 7581392, related citations] [Full Text] 2. Choi, B. Y., Kim, D.-H., Chung, T., Chang, M., Kim, E.-H., Kim, A. R., Seok, J., Chang, S. O., Bok, J., Kim, D., Oh, S.-H., Park, W.-Y. Destabilization and mislocalization of POU3F4 by C-terminal frameshift truncation and extension mutation. Hum. Mutat. 34: 309-316, 2013.[PubMed: 23076972, related citations] [Full Text] 3. Crovetto, M. A., Whyte, J., Sarasola, E., Rodriguez, J. A., Garcia-Barcina, M. J. Absence of COCH gene mutations in patients with superior semicircular canal dehiscence. (Letter)Am. J. Med. Genet. 158A: 251-253, 2012. [PubMed: 22139968, related citations] [Full Text] 4. de Kok, Y. J. M., Cremers, C. W. R. J., Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M. The molecular basis of X-linked deafness type 3 (DFN3) in two sporadic cases: identification of a somatic mosaicism for a POU3F4 missense mutation. Hum. Mutat. 10: 207-211, 1997.[PubMed: 9298820, related citations] [Full Text] 5. de Kok, Y. J. M., Merkx, G. F. M., van der Maarel, S. M., Huber, I., Malcolm, S., Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M. A duplication/paracentric inversion associated with familial X-linked deafness (DFN3) suggests the presence of a regulatory element more than 400 kb upstream of the POU3F4 gene. Hum. Molec. Genet. 4: 2145-2150, 1995. [PubMed: 8589693,related citations] [Full Text] 6. de Kok, Y. J. M., van der Maarel, S. M., Bitner-Glindzicz, M., Huber, I., Monaco, A. P., Malcolm, S., Pembrey, M. E., Ropers, H.-H., Cremers, F. P. M. Association between X-linked mixed deafness and mutations in the POU domain gene POU3F4. Science 267: 685-688, 1995. [PubMed: 7839145, related citations] [Full Text] 7. Douville, P. J., Atanasoski, S., Tobler, A., Fontana, A., Schwab, M. E. The brain-specific POU-box gene Brn4 is a sex-linked transcription factor located on the human and mouse X chromosomes. Mammalian Genome 5: 180-182, 1994. [PubMed: 7911044, related citations] 8. Friedman, R. A., Bykhovskaya, Y., Tu, G., Talbot, J. M., Wilson, D. F., Parnes, L. S., Fischel-Ghodsian, N. Molecular analysis of the POU3F4 gene in patients with clinical and radiographic evidence of X-linked mixed deafness with perilymphatic gusher. Ann. Otol. Rhinol. Laryng. 106: 320-325, 1997. [PubMed: 9109724, related citations] 9. Minowa, O., Ikeda, K., Sugitani, Y., Oshima, T., Nakai, S., Katori, Y., Suzuki, M., Furukawa, M., Kawase, T., Zheng, Y., Ogura, M., Asada, Y., Watanabe, K., Yamanaka, H., Gotoh, S., Nishi-Takeshima, M., Sugimoto, T., Kikuchi, T., Takasaka, T., Noda, T. Altered cochlear fibrocytes in a mouse model of DFN3 nonsyndromic deafness. Science 285: 1408-1411, 1999. [PubMed: 10464101, related citations] [Full Text] 10. Phelps, P. D., Reardon, W., Pembrey, M., Bellman, S., Luxom, L. X-linked deafness, stapes gushers and a distinctive defect of the inner ear. Neuroradiology 33: 326-330, 1991.[PubMed: 1922747, related citations] 11. Phippard, D., Boyd, Y., Reed, V., Fisher, G., Masson, W. K., Evans, E. P., Saunders, J. C., Crenshaw, E. B., III. The sex-linked fidget mutation abolishes Brn4/Pou3f4 gene expression in the embryonic inner ear. Hum. Molec. Genet. 9: 79-85, 2000. [PubMed:10587581, related citations] [Full Text] 12. Reardon, W., Middleton-Price, H. R., Sandkuijl, L., Phelps, P., Bellman, S., Luxon, L., Pembrey, M. E., Malcolm, S. A multipedigree linkage study of X-linked deafness: linkage to Xq13-q21 and evidence for genetic heterogeneity. Genomics 11: 885-894, 1991.[PubMed: 1783396, related citations] [Full Text]

▸ Contributors: Cassandra L. Kniffin - updated : 3/27/2013 Creation Date: Victor A. McKusick : 3/12/1996 ▸ Edit History: carol : 03/03/2015

 

 

 

 

 

 

 

 

OTOF -related Sordità

Sinonimi: DFNB9, DFNB9 non sindromica perdita dell'udito

Un Eliot Shearer, MD, PhD e Richard JH Smith, MD.

Autore Informazioni

Distacco iniziale: 29 feb, 2008; Ultimo aggiornamento: 30 LUGLIO 2015.

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Caratteristiche cliniche.

OTOF -related sordità (DFNB9 perdita di udito non sindromica) è caratterizzata da due fenotipi: prelinguale perdita di udito non sindromica e, meno frequentemente, sensibile alla temperatura non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN). La perdita di udito non sindromica è bilaterale grave a profondacongenita sordità. Nei primi uno o due anni di vita, OTOF -related la sordità può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test elettrofisiologico in cui uditivi risposte del tronco cerebrale (ABR) sono assenti e le emissioni otoacustiche (OAEs) sono presenti. Tuttavia, con il tempo OAE scompaiono e test elettrofisiologico è più coerente con un difetto cocleare. La distinzione tra neuropatia uditiva e un difetto cocleare è importante come impianti cocleari possono essere di valore marginale in persone con neuropatia uditiva ma hanno dimostrato di essere efficace per gli individui con OTOF -related sordità. TS-NSAN è caratterizzata da perdita normale-a-mite audizione in assenza di febbre e significativa perdita di udito che vanno da grave a profonda in presenza di febbre. Quando la febbre si risolve, sentendo ritorna normale.

Diagnosi / testing.

La diagnosi di sordità OTOF -related si sospetta sulla base di dati clinici, inclusi i risultati delle ABR e OAE. La diagnosi è confermata dalla identificazione di varianti sordità legati biallelic in OTOF, ilgene che codifica per la proteina otoferlin.

Gestione.

Trattamento delle manifestazioni: in soggetti con nonsyndromic bilaterale congenita perdita di udito, apparecchi acustici nel più breve tempo possibile, la considerazione di impianti cocleari, che hanno dimostrato di essere efficace per OTOF -related sordità, e programma educativo per le persone con deficit uditivo.

Prevenzione delle manifestazioni primarie: Per gli individui con TS-NSAN, prevenire febbri e le altre condizioni di attività / ambientali che potrebbero causare la temperatura corporea a salire.

Sorveglianza: Negli individui con nonsyndromic bilaterale congenita perdita di udito, l'esame semestrale / annuale da un medico familiare con deficit uditivo ereditario, ripetere audiometria inizialmente ogni tre-sei mesi per determinare se la perdita dell'udito è progressiva.

La valutazione dei parenti a rischio: la valutazione di fratelli e sorelle il più presto possibile dopo la nascita per la perdita dell'udito; se le varianti sordità legati OTOF della famiglia sono noti, test di genetica molecolare di fratelli e sorelle subito dopo la nascita in modo che un adeguato supporto e la gestione precoce possono essere forniti per il bambino e la famiglia.

Consulenza genetica.

OTOF sordità -related è ereditata come autosomica recessiva maniera. Al momento del concepimento, ogni sib di un individuo con OTOF -related sordità ha una probabilità del 25% di avere OTOFsordità -related, una probabilità del 50% di essere un corriere, e una probabilità del 25% di non avere una variante sordità legata in OTOF. Test Carrier per i parenti e test prenatale per gravidanze sono possibili se sono note le varianti sordità legati in una famiglia.

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OTOF -related Sordità: Incluso Fenotipi 1
Prelinguale perdita di udito non sindromica Sensibile alla temperatura non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN)

Per i sinonimi e nomi obsoleti vedere nomenclatura.

1.

Per le altre cause genetiche di questi fenotipi, vedere Diagnosi differenziale.

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Risultati Suggestive

OTOF -related sordità deve essere sospettata in individui con:

• Congenita neuropatia uditiva senza una storia di fattori ambientali causali (ad esempio, iperbilirubinemia neonatale e ipossia neonatale);
• Sensibile alla temperatura non sindromica neuropatia uditiva.

Nota: Durante i primi uno o due anni di vita, OTOF -related la sordità può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test elettrofisiologico in cui uditivi risposte del tronco cerebrale (ABR) sono assenti e le emissioni otoacustiche (OAEs) sono presenti. Tuttavia, con il tempo OAE scompaiono e test elettrofisiologico diventa più coerente con un difetto cocleare.

Stabilire la diagnosi

La diagnosi di OTOF -related sordità è stabilito in un probando con l'identificazione di varianti sordità legati biallelic in OTOF su test di genetica molecolare (vedi tabella 1).

Metodi di analisi molecolari possono includere singolo gene sperimentazione, l'uso di un pannello multi-gene,e test genomico.

• Singolo gene test. Analisi della sequenza di OTOF viene eseguita prima seguita da gene targeting analisi delezione / duplicazione se viene rilevato un unico o no variante di sordità legate.
• Un multi-gene pannello che include OTOF e altri geni di interesse (vedi Diagnosi differenziale) può essere presa in considerazione se il test singolo-gene è negativa o come test di prima linea, se il test singolo-gene non è disponibile per OTOF. Nota: I geni inclusi e sensibilità di pannelli multi-gene variano da laboratorio e nel tempo.
• Test genomico può essere presa in considerazione se singola seriale gene testing (e / o l'uso di un pannello multi-gene) non hanno confermato la diagnosi in un individuo con caratteristiche di OTOF -related sordità. I test possono includere tutto il sequenziamento dell'esoma (WES), all'in- grosso del genoma sequenziamento (WGS), e il sequenziamento dell'intero mitocondriale (WMitoSeq). 
  
  Per problemi da considerare nella interpretazione dei risultati dei test genomici, clicca qui.

Tabella 1.

Ricerca di genetica molecolare Utilizzato in OTOF -related Sordità

Gene1	Metodo di prova	Percentuale di probandi con Sordità-correlate varianti 2rilevabili con questo metodo
OTOF	Le analisi della sequenza 3	99%
	Gene targeting delezione / duplicazione analisi 4	Sconosciuto 5

1.

Vedi Tabella Geni A. e database per cromosoma locus e proteine.

2.

Vedere Genetica Molecolare per informazioni sulle varianti alleliche rilevati in questo gene.

3.

Le analisi della sequenza rileva le varianti che sono benigni, probabilmente benigno, di significato incerto, probabilmente la sordità legata, o sordità correlati. Varianti sordità correlati possono includere piccole intragenica delezioni / inserzioni e missense, nonsense, e varianti sito di splicing; tipicamente, esone o all'in- grosso gene delezioni / duplicazioni non vengono rilevati. Per problemi da considerare nell'interpretazione di analisi di sequenza risultati, fare clic qui.

4.

Gene targeting analisi delezione / duplicazione rileva delezioni o duplicazioni intragenica e può essere eseguito come un singolo o multi-gene pannello. I metodi che possono essere utilizzati possono includere: PCR quantitativa, a lungo raggio PCR, multiplex ligation-dipendente probe amplificazione (MLPA), o un microarray gene targeting progettato per rilevare mono esone delezioni o duplicazioni.

5.

C'è stata una segnalazione di una delezione che coinvolge OTOF [Zadro et al 2010], ma un recente studio di valutazione CNVs in 686 soggetti con perdita di udito non mostravano copia numero varianti in OTOF [Shearer et al 2014] e di conseguenza il tasso di rilevamento è sconosciuto.

Geneticamente Correlate (alleliche) Disturbi

Nessun fenotipi diversi da quelli discussi in questo GeneReview sono noti per essere associati con varianti sordità correlati al OTOF.

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Descrizione clinica

I due fenotipi osservati nei OTOF -related sordità sono prelinguale perdita di udito non sindromica e, meno frequentemente, sensibile alla temperatura non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN).

OTOF -related perdita di udito non sindromica è caratterizzata da prelinguale, la sordità di solito grave a profonda senza anomalie dell'orecchio interno alla RM o TAC esame delle ossa temporali. Grave la sordità è definita come la perdita di 71-90 dB dell'udito; sordità profonda è una perdita uditiva superiore a 90 dB.

TS-NSAN presenta tipicamente con normale da lieve perdita dell'udito quando l'individuo è afebrile. Con comparsa di febbre, le persone con TS-NSAN hanno una significativa perdita di udito che vanno da grave a profonda; udito torna alla normalità una volta che la febbre è stato risolto. Discriminazione discorso è stato descritto come normale è leggermente diminuito al basale con significativo peggioramento durante i periodi febbrili.

Genotipo-fenotipo Correlazioni

Solo limitato genotipo - fenotipo correlazioni sono state fatte, che coinvolge soprattutto i rapporti di sensibile alla temperatura non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN).

• Una variante troncando patogena, c.4467dupC (p.Ile1490HisfsTer19), ha causato una grave perdita di udito da profondi mentre un cambiamento missenso omozigote, c.4718T> C (p.Ile1573Thr), ha causato una perdita di udito moderata che era progressista [Yildirim -Baylan et al 2014].
• Un missense allele, c.1544T> C (p.Ile515Thr), è stato trovato nel eterozigoti state in un individuo che è stato osservato per avere TS-NSAN [Varga et al 2006].
• Una delezione, c.5410_5412delGAG (p.Glu1804del), è stato segnalato per essere omozigote in tre membri di una famiglia con simili TS-NSAN [Marlin et al 2010].
• Un individuo è stato trovato ad avere c.2975_2976delAG (p.Gln994ValfsTer7) e c.4819C> T (p.Arg1607Trp) varianti sordità legate a OTOF su workup per TS-NSAN [Wang et al 2006].

Nomenclatura

Perdita di udito non sindromica causata da mutazioni di OTOF rischia di essere classificato come neuropatia uditiva quando prima rilevata nei neonati nel sentire le prove a causa di assenza di risposte uditive del tronco encefalico (ABR) e la presenza di otoemissioni acustiche (OAEs). Tuttavia, questa mancata corrispondenza scompare nel corso del tempo in modo tale che la sordità a causa di OTOF assomiglia ad un tipico sordità genetica cocleare da diversi anni di età. Dissincronia uditiva è un termine storico usato per descrivere la mancata corrispondenza tra l'attività esterna e interna delle cellule dei capelli riflessa dalla differenza tra ABR e test OAE e neuropatia uditiva o uditiva disturbo dello spettro la neuropatia è preferito.

Prevalenza

La prevalenza mondiale di varianti sordità legata OTOF nelle persone con grave a profonda congenitaautosomica recessiva sordità sindromica rimane sconosciuto.

• Gli studi in popolazioni spagnole suggeriscono che OTOF può essere responsabile di 5% -8% dei prelinguale autosomica recessiva perdita di udito [Rodríguez-Ballesteros et al 2008].
• Uno studio della popolazione pakistana suggeriscono che la frequenza delle varianti sordità relativo è di circa il 2,3% nelle persone con recessiva congenita / prelinguale insorgenza grave da sordità profonda[Choi et al 2009].

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Congenita (o prelinguale) ereditato ipoacusia colpisce circa uno su 1.000 neonati; Il 30% di questi bambini hanno anomalie aggiuntive, rendendo la diagnosi di una forma sindromica di ipoacusia possibile (vedereereditaria Sordità e dell'udito Panoramica perdita). Nei paesi sviluppati, circa la metà dei restanti figli (cioè, il 70% con compromissione di udito non sindromica) segregate varianti sordità legate a GJB2 [Smith et al 2005].Varianti in 28 geni (tra cui OTOF) sono stati implicati in congenita autosomica recessiva sordità non sindromica

Altre neuropatie ereditarie uditive non sindromiche sono i seguenti:

• DFNB59, autosomica recessiva neuropatia uditiva causata da varianti DFNB59, il gene che codifica per la proteina pejvakin [Delmaghani et al 2006, Schwander et al 2007]
• Autosomica dominante neuropatia uditiva causata da varianti in DIAPH3, il gene della proteina di codifica omologo diafana 3

Varianti sordità legata OTOF sono estremamente improbabile in un bambino con grave a profonda perdita dell'udito in un solo orecchio e le risposte elettrofisiologiche coerenti con neuropatia uditiva. Invece, un difetto cocleare dovrebbe essere considerata; La RM è indicata [Buchman et al 2006].

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Le valutazioni dopo la diagnosi iniziale

Per stabilire la misura del coinvolgimento in un individuo con diagnosi di OTOF -related sordità, le seguenti valutazioni sono raccomandati (vedi ereditaria Sordità e dell'udito Panoramica Loss):

• La valutazione di acuità uditiva (prove di emissione ABR, toni puri audiometria)
• Si consideri la consultazione con un genetista medico e / o un consulente genetico

Trattamento delle manifestazioni

Vedere ereditaria sordità e perdita dell'udito Panoramica per i dettagli.

Audizione abilitazione per quelli con non sindromica bilaterale congenita perdita di udito

• Gli apparecchi acustici devono essere montati il ​​più presto possibile.
• L'impianto cocleare (CI) dovrebbe essere considerato il più presto possibile. Case report hanno mostrato buoni risultati di CI in individui con OTOF -related sordità [Rouillon et al 2006, Wu et al 2011] e rivisto in Eppsteiner et al [2012]. 
  Nota: Durante i primi uno o due anni di vita, OTOF -related la sordità può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test elettrofisiologico; tuttavia, con il tempo di test elettrofisiologico diventa più consistente con un difetto cocleare. Distinguere tra una neuropatia uditiva e un difetto cocleare è importante in quanto gli impianti cocleari possono essere di valore marginale in persone con neuropatia uditiva, come quello osservato in neuronopathy sordità-distonia ottica (DDON) [Brookes et al 2008] così come gli individui con sordità causata da varianti patogeniche nei geni-gangliari espresso spirale[Eppsteiner et al 2012].

I programmi educativi progettati per le persone con danni all'udito sono appropriati.

Prevenzione delle manifestazioni primarie

Per gli individui con TS-NSAN:

• Prevenire episodi febbrili.
• Evitare il livello di esercizio e / o condizioni ambientali che causerebbe temperatura corporea a salire.
• Trattare episodi febbrili più rapidamente possibile tornare temperatura corporea normale.
• Educare gli individui e dei loro assistenti che l'insorgenza di perdita dell'udito può essere il primo segno di un evento che richiede un trattamento antipiretico / infettiva [Starr et al 1998]. Occorre incoraggiare le opportune precauzioni, tra cui evitare situazioni potenzialmente pericolose o rumorosi.

Sorveglianza

Per gli individui con nonsyndromic bilaterale congenita perdita di udito:

• Esaminare semestralmente o annualmente da un medico familiare con deficit uditivo ereditario.
• Ripetere audiometria inizialmente ogni tre-sei mesi per determinare se la perdita dell'udito è progressiva.

Agenti / Circostanze da evitare

Gli individui con TS-NSAN. Evitare le temperature eccessive del corpo, quando possibile. Studi di follow-up non hanno dimostrato il successo delle misure preventive come un trattamento efficace a lungo termine.

Valutazione del Parenti a rischio

È opportuno chiarire lo status genetico di fratelli e sorelle, apparentemente asintomatici di un probando subito dopo la nascita da test genetici molecolari delle varianti sordità legati OTOF presenti nei probandi in modo che un adeguato supporto e la gestione precoce possono essere forniti per il bambino e la famiglia.

Vedere consulenza genetica per le questioni legate alla sperimentazione di a rischio parenti per consulenza genetica scopi.

Terapie Sotto inchiesta

Ricerca ClinicalTrials.gov per l'accesso alle informazioni sugli studi clinici per un'ampia gamma di condizioni.Nota: Non ci possono essere gli studi clinici per questa condizione.

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La consulenza genetica è il processo di fornitura di individui e famiglie con informazioni sulla natura, l'ereditarietà, e le implicazioni di malattie genetiche per aiutarli a prendere decisioni personali e mediche informate. I seguenti sezione tratta la valutazione del rischio genetico e l'uso della storia familiare e test genetici per chiarire lo status genetico per i familiari. Questa sezione non è destinata a affrontare tutte le questioni personali, culturali, etiche o che gli individui possono affrontare o per sostituire la consultazione con una genetica professionale. -ED.

Modalità di eredità

OTOF sordità -related è ereditata come autosomica recessiva maniera.

Rischio per i familiari

I genitori di un probando

• I genitori di un bambino con OTOF -related sordità sono eterozigoti obbligati (cioè, portatori di una variante OTOF sordità correlati).
• Eterozigoti (vettori) sono asintomatici.

Fratelli e sorelle di un probando

• Al momento del concepimento, ogni sib di un individuo con OTOF -related sordità ha una probabilità del 25% di essere sordo, una probabilità del 50% di essere un corriere, e una probabilità del 25% di non avere una variante sordità legata in OTOF.
• Eterozigoti (vettori) sono asintomatici.

Prole di un probando. I figli di un individuo con OTOF -related sordità sono eterozigoti obbligati (portatori di una variante la sordità legata in OTOF).

Altri membri della famiglia di un probando. Per ogni sib dei genitori del probando, la probabilità di essere un vettore di un OTOF variante sordità relativo è del 50%.

Carrier (eterozigoti) Rilevamento

Test Carrier per i parenti richiede la previa individuazione delle varianti sordità legati OTOF della famiglia.

Genetica Related Issues Counseling

Vedere Gestione, Valutazione di parenti a rischio per le informazioni sul test parenti a fini di diagnosi precoce e trattamento.

Pianificazione famigliare

• Il momento ottimale per la determinazione dello status di genetica e discussione della disponibilità di test prenatale è prima della gravidanza.
• È opportuno offrire una consulenza genetica (compresa la discussione della probabilità che i figli sarà opzioni sordi e riproduttivi) di giovani adulti che hanno OTOF -related sordità, sono portatori, o possono essere portatori.

I seguenti punti sono degni di nota:

• La comunicazione con le persone che sono sordi richiede i servizi di un interprete qualificato.
• Le persone sorde possono visualizzare la sordità come una caratteristica distintiva e non come un handicap, perdita di valore, o patologie che richiedono una "cura" o "cura", o da "impedito". In effetti, avendo un bambino con la sordità può essere preferito avere un figlio con udito normale.
• Molte persone sorde sono interessati ad ottenere informazioni sulla causa della loro sordità, comprese le informazioni sui servizi sanitari, educativi e sociali, piuttosto che informazioni circa la prevenzione, la riproduzione o la pianificazione familiare. Come in tutta la consulenza genetica, è importante per il consulente di individuare, riconoscere e rispettare / della famiglia dell'individuo domande, dubbi e paure.
• L'uso di alcuni termini è preferito: probabilità o possibilità vs rischio; non udenti e di udito vs udenti.Termini come "affetto", "anormale" e "che causano malattie" dovrebbero essere evitati.

Banking DNA è la conservazione di DNA (tipicamente estratto da globuli bianchi) per un possibile uso futuro.Poiché è probabile che la metodologia di prova e la nostra comprensione dei geni, varianti alleliche, e sordità miglioreranno in futuro, occorre tenere in considerazione per bancaria DNA di affetti individui.

Test prenatale

Se le varianti sordità legati OTOF sono stati identificati in un colpiti membro della famiglia, test prenatale può essere disponibile da un laboratorio clinico che offre sia la sperimentazione di questo gene o test prenatale personalizzato.

Le richieste di test prenatale per le condizioni che (come OTOF -related sordità) non influenzano l'intelletto o durata della vita non sono comuni. Possono esistere differenze di prospettiva tra i professionisti medici e all'interno delle famiglie per quanto riguarda l'uso di test prenatali, in particolare se il test viene presa in considerazione ai fini della interruzione della gravidanza, piuttosto che la diagnosi precoce. Anche se le decisioni riguardanti test prenatale sono la scelta dei genitori, la discussione di questi problemi è appropriato.

Diagnosi genetica preimpianto (PGD) può essere un'opzione per alcune famiglie in cui sono state individuate le varianti sordità legati OTOF.

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Personale GeneReviews ha selezionato le seguenti organizzazioni malattia-specifici e / o di supporto ombrello e / o registri per il beneficio di soggetti con questo disturbo e le loro famiglie. GeneReviews non è responsabile per le informazioni fornite da altre organizzazioni. Per informazioni sui criteri di selezione, clicca qui.

• Alexander Graham Bell Associazione per sordi e udenti

3417 Volta Luogo Northwest

Washington DC 20007

Telefono: 866-337-5220 (numero verde); 202-337-5220; 202-337-5221 (TTY)

Fax: 202-337-8314

Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

Ascolto e Lingua parlata Knowledge Center

• American Society for bambini sordi (ASDC)

800 Florida Avenue Northeast

Suite 2047

Washington DC 20002-3695

Telefono: 800-942-2732 (numero verde Parent Hotline); 866-895-4206 (voce verde / TTY)

Fax: 410-795-0965

E-mail: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.; Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

www.deafchildren.org

• udito del mio bambino

Il sito, sviluppato con il sostegno del National Institute on Deafness e altri disturbi della comunicazione, fornisce informazioni su screening uditivo neonatale e perdita dell'udito.

www.babyhearing.org

• Associazione Nazionale dei Sordi (NAD)

8630 Fenton Street

Suite 820

Silver Spring MD 20910

Telefono: 301-587-1788; 301-587-1789 (TTY)

Fax: 301-587-1791

Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

www.nad.org

• National Library of Medicine Genetics Home Reference

La sordità non sindromica

• Geni NCBI e malattia

Sordità

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Le informazioni contenute in tabelle Genetica Molecolare e OMIM può differire da quello in altre parti del GeneReview: tavoli può contenere informazioni più recenti. - ED.

Tabella A.

OTOF-Related Sordità: Geni e database

Locus Nome	Gene	Cromosoma Locus	Proteina	Locus specifico	HGMD
DFNB9	OTOF	2p23 .3	Otoferlin	Sordità Gene Mutation Database (OTOF)  Ereditaria perdita dell'udito Homepage (OTOF)  CCHMC - Genetica Umana Mutation Database (OTOF)	OTOF

I dati sono compilati dai seguenti riferimenti standard: gene da HGNC; cromosoma locus, nome luogo, regione critica, complementazione gruppo da OMIM; proteine ​​da UniProt. Per una descrizione di database (Locus specifico, HGMD) a cui vengono forniti i link, clicca qui.

Tabella B.

OMIM Voci per OTOF-Related Sordità (Vedi tutti in OMIM)

601.071	SORDITA ', autosomica recessiva 9; DFNB9
603.681	OTOFERLIN; OTOF

Genetica molecolare Patogenesi

Otoferlin appartiene ad una piccola famiglia di proteine ​​citosoliche membrana ancorata che include dysferlin (codificata dal DYSF), myoferlin (codificata dal MYOF), e un quarto membro predetto fer-1-like proteine ​​4 (codificata dal FER1L4). I geni Ferlin sono così chiamati a causa della loro somiglianza strutturale a un genetrovato in C. elegans, fer-1, che è richiesto per il normale maturazione degli spermatozoi.

Con l'eccezione di OTOF, perdita dell'udito non è stata associata con i membri di questo gene famiglia DYSF è associata con tre diversi tipi di miopatie distali:. Miyoshi miopatia (MM), arti muscolare dei cingoli di tipo distrofia 2B (LGMD2B), e miopatia distale con insorgenza anteriore tibiale (DMAT) [Bashir et al 1998, Liu ed altri 1998, Weiler ed altri 1999] (vedi Dysferlinopathy). Myoferlin, che è codificata dal MYOF, è necessaria per il normale fusione dei mioblasti [Doherty et al 2005]. La funzione di fer-1-4 come le proteine ​​non è nota (figura 1).

Figura 1.

Proteine ​​organizzazione motivo per il gene famiglia Ferlin umana come determinato da SMART [Schultz et al 1998 Letunic et al 2002] 
C2 (verde) è il motivo legante il calcio. 
CC (giallo) è un dominio avvolto a spirale. 
TM (blu) è il transmembrana (more ...)

Gene struttura. OTOF composto da 48 esoni codificanti che si estendono oltre 100 kb di genomica DNA. I brevi isoforme hanno solo tre C2 domini. Per un riepilogo dettagliato delle gene informazioni e proteine, veditabella A, Gene.

Varianti alleliche benigni. Sono stati descritti una serie di varianti alleliche non patogeni. Vedi Tabella 3 (pdf).

. Varianti alleliche patogeni Le 117 varianti sordità correlati che sono stati riportati in OTOF sono distribuiti in tutto il gene; vedere Sordità Variazione del database [MORL 2015] e tabella 4 (pdf). La maggior parte sono previsti per essere inattivando varianti e sono associati con grave da sordità profonda [Yasunaga et al 1999,Adato et al 2000, Yasunaga et al 2000, Houseman et al 2001, Migliosi et al 2002, Mirghomizadeh et al 2002,Rodríguez Ballesteros et al 2003, Varga et al 2003, Hutchin et al 2005, Tekin et al 2005, Rouillon et al 2006,Varga et al 2006]. Nessun varianti sordità correlati sono stati segnalati per essere più frequente in specifici gruppi etnici con l'eccezione di c.2485C> T (p.Gln829Ter), che è presente in 3% -5% della popolazione spagnola con grave a profonda non sindromica, sordità prelinguale [Migliosi et al 2002, Rodríguez-Ballesteros et al 2003] (Figura 2).

Figura 2.

Schema di OTOF sul cromosoma 2p23. La struttura genomica OTOF comprende 48 esoni che vengono utilizzati per trascrivere la lunga isoforma (NM_194248.1; NP_919224.1). La breve isoforma non include i primi 19 esoni, che sono indicati come barre blu. La proteina (more ...)

Tabella 2.

Selezionata OTOF Sordità-Related allelica varianti

DNA Nucleotide Change  (Alias ​​1)	Proteine ​​Amino Acid Change  (Alias ​​1)	Riferimenti	Sequenze di riferimento
c.1544T> C	p.Ile515Thr	Mirghomizadeh et al [2002]	NM_194248 .2  NP_919224 .1
c.2485C> T	p.Gln829Ter	Migliosi et al [2002], Rodríguez-Ballesteros et al [2003]
c.2975_2976delAG  (2975_2978delAG	p.Gln994ValfsTer7  (Gln994Valfs * 6)	Wang ed altri [2010]
c.4467dupC	p.Ile1490HisfsTer19	Yildirim-Baylan et al [2014]
c.4718T> C	p.Ile1573Thr	Yildirim-Baylan et al [2014]
c.4819C> T	p.Arg1607Trp	Wang ed altri [2010]
c.5410_5412delGAG	p.Glu1804del	Marlin e altri [2010]

Nota sulla classificazione variante: Varianti elencate nella tabella sono stati forniti dagli autori personale GeneReviews non sono verificate in modo indipendente la classificazione delle varianti..

Nota sulla nomenclatura: GeneReviews segue le convenzioni di denominazione standard del Genome Variation società umana(www .hgvs.org). Vedere di riferimento rapido per una spiegazione di nomenclatura.

1.

Designazione Variante che non è conforme alle convenzioni di denominazione corrente

Normal prodotto genico. Trascritti splicing alternativo combinato con l'uso di vari differenti traduzioneiniziazione siti producono più corti e lunghi isoforme della proteina [Yasunaga ed altri 1999, Yasunaga et al 2000]. I primi 19 esoni sono unici per i lunghi isoforme, che contengono sei moduli leganti il ​​calcio strutturali chiamati domini C2 essenziale per vescicole-fusione della membrana, un dominio avvolto a spirale, e un dominio transmembrana. Le lunghe isoforme di otoferlin hanno 1997 aminoacidi con sei C2 domini, un dominio avvolto a spirale e un dominio transmembrana, e portano omologia al sinaptica proteina delle vescicole synaptotagamin. I domini C2 legano fosfolipidi in presenza di calcio e sono implicati in fusione delle membrane. Roux et al [2006] ipotizzare è necessario che otoferlin per l'alto tasso di fusione delle vescicole sinaptiche nelle cellule ciliate interne.

Anormale prodotto genico. 68 delle 117 varianti sordità legata noti sono inattivando varianti che portano proteine ​​significativamente anormale o, in caso di nonsense-mediata mRNA decay, nessuna proteina affatto.Molte persone con OTOF -related sordità ha due varianti inattivanti, suggerendo che la sordità profonda associata a questo genotipo riflette la totale assenza di otoferlin. Nelle persone che sono eterozigoti composti per due varianti missenso sordità correlati, o una variante di inattivazione e una variante missense, la variante missense è previsto per funzionare difettoso. Sia funzione difettosa (a) altera i tempi di fusione delle vescicole sinaptiche, determinando così una perdita di codifica temporale (dissincronia uditiva), o (b) si accumula nelle vescicole perturbano trasporto nelle cellule ciliate interne non è noto. E 'possibile che le differenze funzionali possono essere associati a differenze fenotipiche riflesse dalle differenze di acuità uditiva, anche se sono necessari ulteriori studi per stabilire se un fenotipo esistono correlazioni -genotype in associazione con proteine ​​otoferlin anormale.

Nel topo, otoferlin è espresso in cocleare, vestibolare, e il tessuto cerebrale [Yasunaga et al 1999]. Mouse cervello e coclea hanno distinte isoforme differenti principalmente nella inclusione di esoni 6 e 47. La conseguenza di inserimento di quest'ultimo esone è una sequenza proteica distinta C-terminale. Tranne per l'assenza di una breve isoforma mouse isoforma espressione tessuto-specifica è concordante tra topo e umani[Yasunaga et al 2000].

1. Adato A, Raskin L, Petit C, Bonne-Tamir B. Deafness heterogeneity in a Druze isolate from the Middle East: novel OTOF and PDS mutations, low prevalence of GJB2 35delG mutation and indication for a new DFNB locus. Eur J Hum Genet. 2000; 8 :437–42. [ PubMed ]
2. Bashir R, Britton S, Strachan T, Keers S, Vafiadaki E, Lako M, Richard I, Marchand S, Bourg N, Argov Z, Sadeh M, Mahjneh I, Marconi G, Passos-Bueno MR, Moreira Ede S, Zatz M, Beckmann JS, Bushby K. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy type 2B. Nat Genet. 1998; 20 :37–42. [ PubMed ]
3. Brookes JT, Kanis AB, Tan LY, Tranebjaerg L, Vore A, Smith RJ. Cochlear implantation in deafness-dystonia-optic neuronopathy (DDON) syndrome. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2008; 72 :121–126. [PubMed ]
4. Buchman CA, Roush PA, Teagle HF, Brown CJ, Zdanski CJ, Grose JH. Auditory neuropathy characteristics in children with cochlear nerve deficiency. Ear Hear. 2006; 27 :399–408. [ PubMed ]
5. Choi BY, Ahmed ZM, Riazuddin S, Bhinder MA, Shahzad M, Husnain T, Riazuddin S, Griffith AJ, Friedman TB. Identities and frequencies of mutations of the otoferlin gene (OTOF) causing DFNB9 deafness in Pakistan. Clin Genet. 2009; 75 :237–43. [ PMC free article ] [ PubMed ]
6. Delmaghani S, del Castillo FJ, Michel V, Leibovici M, Aghaie A, Ron U, Van Laer L, Ben-Tal N, Van Camp G, Weil D, Langa F, Lathrop M, Avan P, Petit C. Mutations in the gene encoding pejvakin, a newly identified protein of the afferent auditory pathway, cause DFNB59 auditory neuropathy. Nat Genet. 2006; 38 :770–8. [ PubMed ]
7. Doherty KR, Cave A, Davis DB, Delmonte AJ, Posey A, Earley JU, Hadhazy M, McNally EM. Normal myoblast fusion requires myoferlin. Development. 2005; 132 :5565–75. [ PMC free article ] [ PubMed ]
8. Eppsteiner RW, Shearer AE, Hildebrand MS, Deluca AP, Ji H, Dunn CC, Black-Ziegelbein EA, Casavant TL, Braun TA, Scheetz TE, Scherer SE, Hansen MR, Gantz BJ, Smith RJ. Prediction of cochlear implant performance by genetic mutation: the spiral ganglion hypothesis. Hear Res. 2012; 292:51–8. [ PMC free article ] [ PubMed ]
9. Houseman MJ, Jackson AP, Al-Gazali LI, Badin RA, Roberts E, Mueller RF. A novel mutation in a family with non-syndromic sensorineural hearing loss that disrupts the newly characterised OTOF long isoforms. J Med Genet. 2001; 38 :E25. [ PMC free article ] [ PubMed ]
10. Hutchin T, Coy NN, Conlon H, Telford E, Bromelow K, Blaydon D, Taylor G, Coghill E, Brown S, Trembath R, Liu XZ, Bitner-Glindzicz M, Mueller R. Assessment of the genetic causes of recessive childhood non-syndromic deafness in the UK - implications for genetic testing. Clin Genet. 2005; 68:506–12. [ PubMed ]
11. Letunic I, Goodstadt L, Dickens NJ, Doerks T, Schultz J, Mott R, Ciccarelli F, Copley RR, Ponting CP, Bork P. Recent improvements to the SMART domain-based sequence annotation resource. Nucleic Acids Res. 2002; 30 :242–4. [ PMC free article ] [ PubMed ]
12. Liu J, Aoki M, Illa I, Wu C, Fardeau M, Angelini C, Serrano C, Urtizberea JA, Hentati F, Hamida MB, Bohlega S, Culper EJ, Amato AA, Bossie K, Oeltjen J, Bejaoui K, McKenna-Yasek D, Hosler BA, Schurr E, Arahata K, de Jong PJ, Brown RH Jr. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nat Genet. 1998; 20 :31–6. [ PubMed ]
13. Marlin S, Feldmann D, Nguyen Y, Rouillon I, Loundon N, Jonard L, Bonnet C, Couderc R, Garabedian EN, Petit C, Denoyelle F. Temperature-sensitive auditory neuropathy associated with an otoferlin mutation: Deafening fever! Biochem Biophys Res Commun. 2010; 394 :737–42. [ PubMed ]
14. Migliosi V, Modamio-Hoybjor S, Moreno-Pelayo MA, Rodriguez-Ballesteros M, Villamar M, Telleria D, Menendez I, Moreno F, Del Castillo I. Q829X, a novel mutation in the gene encoding otoferlin (OTOF), is frequently found in Spanish patients with prelingual non-syndromic hearing loss. J Med Genet. 2002; 39 :502–6. [ PMC free article ] [ PubMed ]
15. Mirghomizadeh F, Pfister M, Apaydin F, Petit C, Kupka S, Pusch CM, Zenner HP, Blin N. Substitutions in the conserved C2C domain of otoferlin cause DFNB9, a form of nonsyndromic autosomal recessive deafness. Neurobiol Dis. 2002; 10 :157–64. [ PubMed ]
16. MORL. Deafness variation database – OTOF. The University of Iowa: The Molecular Otolaryngology and Renal Research Laboratory. Available online . 2015. Accessed 7-28-15.
17. Rodríguez-Ballesteros M, del Castillo FJ, Martin Y, Moreno-Pelayo MA, Morera C, Prieto F, Marco J, Morant A, Gallo-Teran J, Morales-Angulo C, Navas C, Trinidad G, Tapia MC, Moreno F, del Castillo I. Auditory neuropathy in patients carrying mutations in the otoferlin gene (OTOF). Hum Mutat. 2003; 22:451–6. [ PubMed ]
18. Rodríguez-Ballesteros M, Reynoso R, Olarte M, Villamar M, Morera C, Santarelli R, Arslan E, Medá C, Curet C, Völter C, Sainz-Quevedo M, Castorina P, Ambrosetti U, Berrettini S, Frei K, Tedín S, Smith J, Cruz Tapia M, Cavallé L, Gelvez N, Primignani P, Gómez-Rosas E, Martín M, Moreno-Pelayo MA, Tamayo M, Moreno-Barral J, Moreno F, del Castillo I. A multicenter study on the prevalence and spectrum of mutations in the otoferlin gene (OTOF) in subjects with nonsyndromic hearing impairment and auditory neuropathy. Hum Mutat. 2008; 29 :823–31. [ PubMed ]
19. Rouillon I, Marcolla A, Roux I, Marlin S, Feldmann D, Couderc R, Jonard L, Petit C, Denoyelle F, Garabedian EN, Loundon N. Results of cochlear implantation in two children with mutations in the OTOF gene. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2006; 70 :689–96. [ PubMed ]
20. Roux I, Safieddine S, Nouvian R, Grati M, Simmler MC, Bahloul A, Perfettini I, Le Gall M, Rostaing P, Hamard G, Triller A, Avan P, Moser T, Petit C. Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell. 2006; 127 :277–89. [ PubMed ]
21. Schultz J, Milpetz F, Bork P, Ponting CP. SMART, a simple modular architecture research tool: identification of signaling domains. Proc Natl Acad Sci US A. 1998; 95 :5857–64. [ PMC free article ] [PubMed ]
22. Schwander M, Sczaniecka A, Grillet N, Bailey JS, Avenarius M, Najmabadi H, Steffy BM, Federe GC, Lagler EA, Banan R, Hice R, Grabowski-Boase L, Keithley EM, Ryan AF, Housley GD, Wiltshire T, Smith RJ, Tarantino LM, Muller U. A forward genetics screen in mice identifies recessive deafness traits and reveals that pejvakin is essential for outer hair cell function. J Neurosci. 2007; 27 :2163–75. [PubMed ]
23. Shearer AE, Kolbe DL, Azaiez H, Sloan CM, Frees KL, Weaver AE, Clark ET, Nishimura CJ, Black-Ziegelbein EA, Smith RJ. Copy number variants are a common cause of non-syndromic hearing loss.Genome Med. 2014; 6 :37. [ PMC free article ] [ PubMed ]
24. Smith RJ, Bale JF Jr, White KR. Sensorineural hearing loss in children. Lancet. 2005; 365 :879–90. [PubMed ]
25. Starr A, Sininger Y, Winter M, Derebery MJ, Oba S, Michalewski HJ. Transient deafness due to temperature-sensitive auditory neuropathy. Ear Hear. 1998; 19 :169–79. [ PubMed ]
26. Tekin M, Akcayoz D, Incesulu A. A novel missense mutation in a C2 domain of OTOF results in autosomal recessive auditory neuropathy. Am J Med Genet A. 2005; 138 :6–10. [ PubMed ]
27. Varga R, Avenarius MR, Kelley PM, Keats BJ, Berlin CI, Hood LJ, Morlet TG, Brashears SM, Starr A, Cohn ES, Smith RJ, Kimberling WJ. OTOF mutations revealed by genetic analysis of hearing loss families including a potential temperature sensitive auditory neuropathy allele. J Med Genet. 2006; 43:576–81. [ PMC free article ] [ PubMed ]
28. Varga R, Kelley PM, Keats BJ, Starr A, Leal SM, Cohn E, Kimberling WJ. Non-syndromic recessive auditory neuropathy is the result of mutations in the otoferlin (OTOF) gene. J Med Genet. 2003; 40 :45–50. [ PMC free article ] [ PubMed ]
29. Wang Q, Lan L, Yu L, Guo M, Chen Z, Gu R. Temperature sensitive auditory neuropathy. J Audiol Sp Pathol (Chinese) 2006; 14 :21–6.
30. Wang DY, Wang YC, Weil D, Zhao YL, Rao SQ, Zong L, Ji YB, Liu Q, Li JQ, Yang HM, Shen Y, Benedict-Alderfer C, Zheng QY, Petit C, Wang QJ. Screening mutations of OTOF gene in Chinese patients with auditory neuropathy, including a familial case of temperature-sensitive auditory neuropathy.BMC Med Genet. 2010; 11 :79. [ PMC free article ] [ PubMed ]
31. Weiler T, Bashir R, Anderson LV, Davison K, Moss JA, Britton S, Nylen E, Keers S, Vafiadaki E, Greenberg CR, Bushby CR, Wrogemann K. Identical mutation in patients with limb girdle muscular dystrophy type 2B or Miyoshi myopathy suggests a role for modifier gene(s). Hum Mol Genet. 1999; 8:871–7. [ PubMed ]
32. Wu C, Liu TC, Wang SH, Hsu CJ, Wu CM. Genetic characteristics in children with cochlear implants and the corresponding auditory performance. Laryngoscope. 2011; 121 :1287–93. [ PubMed ]
33. Yasunaga S, Grati M, Chardenoux S, Smith TN, Friedman TB, Lalwani AK, Wilcox ER, Petit C. OTOF encodes multiple long and short isoforms: genetic evidence that the long ones underlie recessive deafness DFNB9. Am J Hum Genet. 2000; 67 :591–600. [ PMC free article ] [ PubMed ]

34.   Yasunaga S, Grati M, Cohen-Salmon M, El-Amraoui A, Mustapha M, Salem N, El-Zir E, Loiselet J, Petit C. A mutation in OTOF, encoding otoferlin, a FER-1-like protein, causes DFNB9, a nonsyndromic form of deafness. Nat Genet. 1999; 21 :363–9. [ PubMed ]

35. Yildirim-Baylan M, Bademci G, Duman D, Ozturkmen-Akay H, Tokgoz-Yilmaz S, Tekin M. Evidence for genotype-phenotype correlation for OTOF mutations. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2014; 78 :950–3. [ PMC free article ] [ PubMed ]
36. Zadro C, Ciorba A, Fabris A, Morgutti M, Trevisi P, Gasparini P, Martini A. Five new OTOF gene mutations and auditory neuropathy. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2010; 74 :494–8. [ PubMed ]

 

 

PLoS One. 2010; 5 (12): e15907.

Pubblicato online 2010 Dec 31 doi: 10.1371 / journal.pone.0015907

PMCID: PMC3013142

Caratterizzazione di nuovi Otic Enhancer della POU3F4 Gene Reveal Signaling Pathway regolamento e Modelli distinti spazio-temporali

Àlex Robert-Moreno, ¹ Silvia Naranjo, ² Elisa de la Calle-Mustienes, ² José Luis Gómez-Skarmeta, ² e Berta Alsina ^1, *

Bruce Riley, Editor

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POU3F4 è un membro della POE-homedomain fattore di trascrizione famiglia con un ruolo di primo piano nello sviluppo dell'orecchio interno. Le mutazioni nel unità di codifica POU3F4 umano porta a X-linked di tipo sordità 3 (DFN3), caratterizzata da ipoacusia trasmissiva e progressiva sordità neurosensoriale.Microdelezioni trovati 1 Mb 5 'a monte della regione codificante visualizzato anche lo stesso fenotipo, suggerendo che cis-normativo elementi potrebbero essere presenti in quella regione. In effetti, noi ed altri abbiamo recentemente individuato una serie di stimolatori a 1 Mb 5 'intervallo monte del locus POU3F4.Qui ci caratterizzano i modelli spazio-temporali di questi elementi normativi in ​​linee transgeniche zebrafish.Abbiamo dimostrato che l'enhancer più distale (HCNR 81675) si attiva prima e spinge espressione giornalista GFP inizialmente a un dominio orecchio ampia di limitare progressivamente le patch sensoriali.Il potenziatore prossimale (HCNR 82.478) si accende in seguito durante lo sviluppo e promuove l'espressione, tra in altri tessuti, a chiazze sensoriali dal suo esordio. Il terzo enhancer (HCNR 81.728) è attivo anche nelle fasi successive del mesenchima otic e nell'epitelio otic. Abbiamo anche caratterizzare le vie di segnale che regolano questi esaltatori. Mentre HCNR 81675 è regolata da segnali molto precoci di acido retinoico, HCNR 82.478 è regolata dall'attività Fgf in una fase successiva e la HCNR 81.728 enhancer è sotto il controllo del segnale Hh. Infine, ci dimostrano che i fattori di trascrizione Sox2 e Pax2 sono tenuti a HCNR 81675 regione genomica durante lo sviluppo otic e specifiche mutazioni di questi siti di legame fattori di trascrizione abroga HCNR 81675 attività enhancer. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che l'espressione POU3F4 nell'orecchio interno potrebbe essere sotto il controllo di elementi regolatori distinti che perfezionare l'attività di spazio-temporale di questo gene e fornisce dati nuovi sui meccanismi di segnalazione che controllano la funzione POU3F4.

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L'orecchio interno dei vertebrati è uno degli organi di senso più complesse della testa e ospitare due sensi, l'udito e il senso di equilibrio. Da uno strato ectodermica adiacente hindbrain, placode otic, un organo sferoide è generato da invaginazione / cavitazione seguito da una serie di processi di sviluppo come patterning, diversificazione cellulare e morfogenesi. Nella parte ventrale dell'orecchio interno, la coclea o organo uditivo emerge come outpocketing della vescicola otica, mentre nella parte dorsale della vescicola otica organi vestibolari, canali semicircolari e dotto endolinfatico sono sviluppati. In ogni organo sensoriale, l'unità funzionale principale è composta dai capelli cellule, le cellule di supporto ei neuroni sensoriali che collegano i capelli cellule del sistema nervoso centrale [1], [2]. L'integrazione dei segnali nell'orecchio interno dai tessuti circostanti è essenziale per il corretto sviluppo. Negli ultimi anni, un gran numero di geni sono stati divulgati a partecipare alla formazione dell'orecchio e controllo attività del gene. Eppure, come quelli interagiscono e sono spazio-temporalmente regolato è ancora poco conosciuta. Regioni non codificanti altamente conservate (HCNR) sono stati rivelati e ha proposto di contenere chiave cis-normativo elementi [3], [4]. Caratteristiche emergenti di queste sequenze sono loro conservazione evolutiva, la loro posizione nel genoma (a monte oa valle e anche in introni del gene che regolano), il loro raggruppamento attorno fattori di trascrizione e loro contributo alla malattia quando mutato [5] - [7] . Ad oggi, sono stati identificati finora pochissime regioni regolatorie controllano interno trascrizione genica orecchio.Recentemente, una regione regolatoria dei geni Dlx5-Dlx6 è stato trovato dallo studio di cinque membri affetti visualizzazione perdita di udito e difetti cranio-facciali. Gli individui affetti condividevano una delezione di 5115 bp. Analisi bioinformatica di questa sequenza indicava la presenza di diversi HCNR, che in un topo transgenico saggio reporter guidato espressione nell'orecchio interno e ossa di sviluppo [8].

Le proteine ​​POU sono fattori di trascrizione che si legano al DNA attraverso le loro regioni specifiche POU e POU-omeodominio e giocano un ruolo essenziale durante lo sviluppo. Diversi membri della famiglia POE sono espressi nell'orecchio interno. Il POU4F3 gene (Brn3c) è specificamente indicato nella capelli cellule e provoca mutazioni POU4F3 DFNA15, una forma autosomica dominante di perdita progressiva dell'udito [9]. Le mutazioni in un altro membro della famiglia POU, il POU3F4 (Brn4) provoca sordità di tipo 3 (DFN3), caratterizzata da una perdita uditiva che deriva dalla fissazione della staffa e progressiva sordità neurosensoriale [10]. Il POU3F4 gene umano si trova nel cromosoma X (Xql3-Q22) essendo una delle più frequenti cause di sordità legata all'X. Nei ratti, il gene è espresso POU3F4 durante lo sviluppo embrionale del cervello, il tubo neurale, e la capsula otica a E15.5 e E17.5 giorni [11]. Nei topi, mutazioni del gene omologo causano difetti simili, come negli esseri umani. Perdita dei tessuti derivati ​​dal mesenchima otic stato riferito, nonché un accorciamento della coclea suggerendo che POU3F4 potrebbe essere richiesto per interazioni epitelio-mesenchimali che avvengono durante lo sviluppo [12], [13]. Negli esseri umani, oltre a mutazioni nella regione codificante, un hotspot 920 Kb 5 'a monte del gene POU3F4 stato identificato dove diverse microdeletions anche causato DFN3 fenotipo, suggerendo che regioni regolatorie erano presenti in quella regione [10], [14] - [16]. Recentemente, utilizzando genomica comparativa e saggi transgenici in diversi sistemi modello, un esaltatore POU3F4 all'interno di un HCNR (HCNR 81.728) è stata descritta per indurre l'espressione giornalista nel mesenchima otic. Questo laico potenziatore nelle microdelezioni piccoli dimostrato di provocare DFN3 [17], [18]. Tuttavia, poiché non tutte le microdelezioni influenzano questo enhancer [16], [19], è stato ipotizzato che altri esaltatori potrebbero essere presenti nella regione hotspot. Riportato in Naranjo et al. (2010) [18], abbiamo identificato due esaltatori aggiuntivi in HCNR situato all'interno del 1 Mb 5 'a monte della regione codificante Xenopus, alla posizione 970 Kb (HCNR 81675) e 170 Kb (HCNR 82.478) dell'unità codifica POU3F4 che presentare otic attività vescicole enhancer in un test di transgenesi zebrafish. Qui, abbiamo analizzato l'attività spazio-temporale di tali esaltatori, nonché le vie di segnalazione che avviano la loro attività. Abbiamo trovato che le HCNRs mostrano pattern temporali distinti di attivazione e; mentre HCNR 81675 è regolato dal acido retinoico (RA) di segnalazione, il HCNR 82.478 è regolata dalla via Fgf e la HCNR 81.728 enhancer è sotto il controllo di Hh. Infine vi presentiamo prova diretta che l'enhancer distale è legato in vivo da Sox2 e fattori di trascrizione Pax2. Nel complesso, questi dati suggeriscono che l'apparato normativo del POU3F4è molteplice, complesso e integrare gli ingressi di sviluppo distinti.

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Etica Dichiarazione

Pesci transgenici Zebrafish sono stati mantenuti presso l'impianto PRBB animali. Il nostro stabulario in conformità con le normative nazionali ed europee è registrato come centro di ricerca animale con il numero B9900073. Supervisione veterinaria e il benessere quotidiano di acqua check-up vengono condotti (ossigeno disciolto, conducibilità, pH, l'ammoniaca, nitriti, nitrati, alcalinità e durezza -Kh e GH, tra gli altri parametri) per garantire agli animali un buono stato di salute. Temperatura, umidità, intensità della luce e il controllo del rumore in sala sono rigorosamente monitorized per garantire il benessere degli animali.Embrioni di zebrafish sono stati sacrificati dopo essere stati anestetizzati con 0,016% tricaine quando necessario. Sono state eseguite le procedure di zebrafish sperimentali seguendo i protocolli (CEEA-PRBB ref JMC-07-1001-CPC e MM-08-1108BAE), approvato dal Comitato Etico per la Ricerca degli animali (CEEA) da Barcellona Parco di Ricerca Biomedica (PRBB) secondo i regolamenti dell'Unione Europea.

Generazione di linee zebrafish transgenici

POU3F4 HCNR 81675 e HCNR linee di zebrafish 82.478 GFP sono stati ottenuti come descritto in [18].In breve, entrambi HCNRs sono stati selezionati sulla base di alta conservazione sequenza del genoma umano utilizzando il browser VISTA (http://pipeline.lbl.gov/cgi-bin/gateway2). Successivamente frammenti genomici sono stati amplificati mediante PCR da Xenopus tropicalis, clonati nel PCR8 / GW / TOPO e linee zebrafish stabili generato dal sistema transgenesi Tol2.

Rilevamento GFP transgenico

POU3F4 HCNR 81675 e 82478 HCNR embrioni GFP sono state organizzate in base alla morfologia e numero della coppia somite. Per la vita di imaging GFP, embrioni tricaine-anesthesized sono stati montati nelle diapositive con glicerolo e le immagini sono state scattate al microscopio.

Tutto il montaggio ibridazione in situ

Tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) è stata effettuata secondo protocolli standard [20].Brevemente, dechorionated zebrafish embrioni sono stati fissati in paraformaldeide 4% notte a 4 ° C e disidratato in serie metanolo, reidratato nuovo e trattati con 10 mg / ml proteinasi K (Sigma) per 10 minuti.Sonde digossigenina-marcate sono state ibridate notte a 58 ° C, rilevato utilizzando pecore anticorpo anti-digossigenina-AP a 1:2000 diluizione (Roche) e sviluppato con NBT / BCIP (Roche). Gli embrioni sono stati utilizzati sia per l'imaging o incorporati nel tessuto-tek ottobre (Sakura) per il sezionamento in un criostato Leica CM1510-1 a 12 micron.

Inhibitor test trattamento

HCNR 81675 e HCNR 82.478 GFP embrioni transgenici erano chorion forato e incubato con diversi inibitori farmacologici in acqua sistema, da 5,5, 7,5 o 9,5 ore dopo la fecondazione (HPF) scena fino al 18-20 HPF o 36-40 HPF rispettivamente. La batteria di inibitori incluso: 30 e 50 micron SU5402 (Calbiochem) per inibire la segnalazione Fgf, 100 micron DAPT (Calbiochem) per inibire la segnalazione Notch, 20 mM DEAB (Sigma) per bloccare la sintesi RA, 30 micron Dorsomorphin (Biomol) per inibire Bmp segnalazione e 45 micron ciclopamina A (CyA) per inibire la segnalazione Hh. DMSO diluito a 1/200 in acqua sistema o EtOH 95% è stato utilizzato come il trattamento di controllo portante.

Immunostaining

Per immunocolorazione dopo DESIDERIO, POU3F4 HCNR 81675 embrioni sviluppati sono stati congelati in tessuto-tek ottobre e sezionati (12 micron). I vetrini sono stati fissati in -20 ° C metanolo per 10 minuti e bloccato-permeabilizzate in siero fetale bovino 10% (FBS), 3% di albumina sierica bovina (BSA) (Sigma) in 0.1% PBT (0,1% di Tween-20) per 90 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati colorati con coniglio anti-GFP (Takara) a 1:400 notte a 4 ° C e asino anti-coniglio Alexa 488 (Molecular Probes) in 1:400 per 90 minuti a temperatura ambiente, sia in 0.1% PBT, 10% FBS, 3% BSA. Le sezioni sono state montate in Mowiol per l'imaging. Per il doppio immunostaining, GFP transgenico è stato in grado di essere rilevato, dopo tutte le lavorazioni, quindi HCNR POU3F4 81675 embrioni sono stati sezionati, bloccato-permeabilizzate e colorate con topo anti-tubulina acetilato (Sigma T6793) o coniglio-PAX2 anti-(laboratori Zymed ref.71 -6000) in 1:400 notte a 4 ° C e di capra anti-topo Alexa 546 o di capra anti-coniglio Alexa 594 (Molecular Probes) in 1:400 per 90 minuti a temperatura ambiente. I nuclei sono stati colorati con 4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Molecular Probes) per 5 minuti e montato in Mowiol.

FM® 4-64FX colorazione

Alive 3 giorni di età POU3F4 HCNR 81675 embrioni sono stati iniettati nella vescicola otica con un micromanipolatore con il reagente FM® 4-64FX (Invitrogen) a 1:05 di diluizione in acqua, e poi a sinistra in acqua sistema per 15 minuti, fissato a 4 % paraformaldeide (Sigma) e congelato nel tessuto-tek ottobre (Sakura) per il sezionamento e di imaging.

Fattore di trascrizione sito di legame (TFBS) la previsione e la mutagenesi sito-specifica

Al fine di prevedere siti TFB conservati nel POU3F4 HCNR 81675 sequenza, sequenze Xenopus umano e sono state analizzate in rVISTA 2.0 (http://rvista.dcode.org/) che predice siti evolutivamente conservato fattori di trascrizione vincolante. Inoltre, la sequenza di Xenopus è stato analizzato anche TRANSFAC 7.0 nel portale regolazione genica (http://www.gene-regulation.com/index.html). PAX2 e Sox2 siti presenti nelPOU3F4 HCNR 81675 legame sono stati sottoposti a mutagenesi sito-specifica. Sulla base del motivo e letteratura di ricerca TRANSFAC, abbiamo mutato i nucleotidi di base dei siti Pax2 e Sox2 vincolanti progettando primer che contenevano il legame GTGAATAG nucleo Pax2 trasformato in TCAAACAT o l'associazione ACAAAA nucleo Sox2 mutato in GTGCTC. Primer mutante sono stati usati per introdurre queste mutazioni puntiformi nel pCR8 / GW / TOPO TA® - HCNR 81675 costrutti con il Quik Change® XL mutagenesi sito-diretta kit (Stratagene). Zebrafish transgenico contenente o Pax2 o siti di legame mutanti Sox2 e il doppio mutante per motivi PAX2 e Sox2 sono stati generati utilizzando il vettore ZED e Tol2 metodo transposon / trasposasi transgenesi [21] e gli embrioni di F1 sono stati analizzati per la presenza di GFP dell'orecchio interno.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) test

Vescicola otica da embrioni palco 24 e la fase 30 di Xenopus stati sezionati e utilizzati per test cromatina immunoprecipitazione. Analisi chip è stato eseguito con piccole modifiche come precedentemente descritto[22]. La cromatina è stato reticolato con formaldeide (Merck), tranciati in 200-500 coppie di basi frammenti di ultrasuoni con un sonicatore Bioruptor Diagenode (velocità media, 8 minuti), incubate durante la notte con coniglio anti-Pax2 (laboratori Zymed) e di coniglio anti-Sox2 (Abcam , Ab15830) anticorpi e precipitato con la proteina G / A-Sepharose (GE Healthcare). Complessi DNA-proteina sono stati decrosslinked e cromatina immunoprecipitato è stato utilizzato per la PCR quantitativa effettuata utilizzando kit Maestro SYBR Green in un sistema LightCycler480 (Roche). Primer PCR per la PAX2 e Sox2 siti di legame nel Xenopus POU3F4 HCNR 81675 sono stati progettati (Sox2TTCCAGTCTTTTCTTTTCCAAAGCT avanti, indietro TTTGCCTTTGGGCGTAATTT; Pax2CAGCATCCATTTAATTCATCAA avanti

ACA, reverse TGAAGTTTCTCTCTTCTGCAACTCTT), mentre primer per una CNR nel Xenopus dell'emoglobina-2 locus senza siti di legame previsti PAX2 e Sox2 secondo database rVISTA e TRANSFAC sono stati utilizzati come controllo negativo (Xenopus scaffold_357: 988.236-988.368;TCTGCTCTCTTGTAGCTGCTGTCT avanti; retromarcia ACTTGTCCCAGGCAGCTTGT ).

Acquisizione di immagini

Le foto sono state acquisite in un microscopio DRM Leica con una fotocamera Leica DFC300 FX e il software Leica IM50. Adobe Photoshop CS2 è stato utilizzato per l'editing fotografia.

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POU3F4 esaltatori dell'orecchio interno attivano l'espressione genica a diversi stadi di sviluppo

Abbiamo recentemente usato genomica comparativa e saggi transgeniche in Xenopus e zebrafish per identificare diverse regioni non codificanti altamente conservate (HCNR) nella regione a monte del sito di inizio POU3F4 trascrizione con l'attività enhancer 1 Mb 5 'nell'orecchio interno in via di sviluppo [18] .Qui usiamo la stessa nomenclatura utilizzata nel nostro rapporto di lavoro precedente. Così, ogni enhancer è chiamato dalla loro posizione nel cromosoma X umano (versione hg18) in kilobasi. HCNR 81675, 81.728 e 82.478 si trovano, rispettivamente, a 970, 922 e 70 Kb parte il POU3F4 sito di inizio della trascrizione (Figura 1A). Per prima determinato l'insorgenza di espressione di ciascun enhancer in linee transgeniche zebrafish stabili ospitano GFP sotto il controllo di ciascuna di queste regioni cis-regolamentazione. In questo e nel nostro precedente lavoro [18], abbiamo osservato che GFP guidato dal enhancer a HCNR 81.728 divenne chiaramente visibile a 72 HPF (dati non riportati). Dal momento che siamo particolarmente interessati agli eventi patterning primi durante lo sviluppo dell'orecchio interno, ci siamo concentrati negli altri due, esaltatori HCNR 81675 e HCNR 82.478, che attivano la trascrizione molto prima. A tal fine, gli embrioni sono stati analizzati per l'espressione della GFP ogni ora dalle 10,5 ore dopo la fecondazione (HPF) a 18,5 HPF, e poi di nuovo a 24 e 36 HPF HPF. Espressione nell'orecchio interno è stato rilevato in HCNR 81675 embrioni di 13,5 HPF (Figura 1B), mentre per HCNR 82.478 GFP otic non è stato trovato prima del 18.5 HPF. Prima di iniziare l'espressione GFP nell'orecchio interno, il potenziatore era attivo nei mesonefro al 17,5 HPF (Figura 1C). Il HCNR 82.478 anche droved espressione nel confine mesencefalo-rombencefalo a 18,5 HPF e al midollo spinale a 24 HPF (Figura 1C).

Figura 1

Temporale pattern di espressione di GFP guidato da POU3F4HCNR 81675 e 82478 HCRN esaltatori.

Per verificare in quale fase, entrambe le esaltatori sono funzionali a livello trascrizionale, tutto il montaggio ibridazione in situ (WISH) per rilevare GFP mRNA è stata eseguita. Voglia Della stessa embrioni stadio ha rivelato che, in entrambi i esaltatori POU3F4, GFP mRNA trascrizione comincia due ore prima che la proteina GFP è rilevabile, a 11,5 e 16,5 HPF HPF rispettivamente (Figura 1D ed E). Così, il mRNA che a livello proteico questi risultati indicano che entrambi esaltatori sono funzionali e regolano l'espressione del gene reporter alla vescicola otica (tra gli altri tessuti nel caso di HCNR 82478) ma attivano l'espressione a diversi stadi di sviluppo.

Presto attivati ​​POU3F4 esaltatori di promuovere l'espressione a tratti sensoriali dell'orecchio interno

Dal momento che sia POU3F4 presto espresso esaltatori di attivare l'espressione della GFP giornalista a diversi stadi di sviluppo di zebrafish, abbiamo prossimo dosati se il modello spaziale di espressione nell'orecchio interno anche presentato particolarità. Da 13 a 24 HPF HPF, GFP guidato da HCNR 81675 si osserva in quasi tutto il placode otic (vedi Figura 1B). Tuttavia, a 24 HPF una vista laterale della vescicola otica rivelato che espressione superiore è concentrata ventrale, in un dominio ampia che comprende le zone di anteriore e posteriore otolith deposizione (Figura 2A, otoliti indicate con un asterisco). Otoliti appaiono a 24 HPF e sono particelle di matrice gelatinosa e carbonato di calcio che si depositano sui capelli cellule del maculae, contribuendo al senso di gravità e accelerazione lineare. D'altra parte, l'espressione promosso da HCNR 82478 a 24 HPF è già ristretta al dominio sensoriale, come giudicato dalla corrispondenza anteriore e posteriore otolith (Figura 2D). Quando gli embrioni raggiungono il vecchio stadio di 3 giorni, le espressioni GFP guidato da entrambi HCNRs POU3F4 diventano limitati a due macule sensoriale e le tre creste sensoriale associata ai canali semicircolari (Figura 2C e F).

Figura 2

Spazio-temporale pattern di espressione di esaltatori POU3F4nell'orecchio interno.

Patch sensoriali sono formate da capelli e cellule di supporto. Così, per determinare se GFP è limitato a qualsiasi lignaggio delle patch sensoriali otic o al contrario espressa in entrambi i tipi di cellule, abbiamo eseguito colorazione o con un anticorpo contro la proteina Pax2 o con mescola FM 4-64FX. In embrioni 3 giorni, la proteina Pax2 si trova solo in capelli cellule nuclei. D'altra parte, il composto FM 4-64FX macchie citoplasma delle cellule ciliate entrando attraverso canali ionici del stereocilia. È interessante notare che, nel caso di HCNR 81675 enhancer, GFP colorazione è stato osservato in cellule di supporto, ma esclusa dalla capelli cellule marcate con Pax2 o composti FM 4-64FX (indicato in rosso nella figura 2G e io, frecce bianche). Tuttavia, nel caso di HCNR 82478, GFP colorazione è stata osservata sia in capelli cellule e cellule di supporto (Figura 2H e J; frecce bianche). GFP è stato trovato anche nel ganglio otico a HCNR 82.478 (ma non per HCNR 81675) pesci transgenici, come mostrato dalle cellule co-immunostained con anti-GFP e anti-Islet1 in neuroblasti anteriore alla vescicola otica (Figura 2K e L).

POU3F4 distinto esaltatori dell'orecchio interno sono sotto il controllo di diverse vie di segnalazione

Successivo abbiamo deciso di affrontare la quale via di segnalazione / s potrebbe controllare l'attivazione dei diversi esaltatori POU3F4 in vivo. Embrioni transgenici per la HCNR 81675 enhancer sono stati trattati da diversi punti temporali con una batteria di inibitori farmacologici di vie di segnalazione distinti. Quando gli embrioni sono stati trattati con inibitori della Fgf (SU5402), la RA (DEAB) e Bmp (Dorsomorphin) percorsi, piccole vescicole otic sono state osservate da tutti e tre i percorsi svolgono un ruolo essenziale nella formazione placode otic [23] - [28]. Al contrario, Notch (DAPT) e Hh (CyA) percorsi inibizione non ha avuto un effetto importante sulle dimensioni della vescicola otica. È interessante notare che l'espressione di GFP guidato da HCNR 81675 enhancer è stato perso solo quando la segnalazione RA è stata abrogata a 5,5 HPF (Figura 3A-G e 3O), ma al più tardi stadi come 7.5 HPF o 9.5 HPF (Figura S1), che indica che il HCNR richiede un segnale di RA presto per essere indotta. Si noti che in queste fasi, Fgf stato inibito a bassa concentrazione di SU5402, poiché ad una concentrazione di 50 mM formazione vescicola otica è gravemente compromessa a causa del requisito di Fgf nell'induzione otica [26] - [29]. Ibridazione in situ per FGF, Notch, RA, Bmp e Hedgehog geni bersaglio, come pea3, NeuroD, krox20, MSX1 e PTC1 è stato fatto negli embrioni inibitori trattato per confermare che ogni via di segnalazione è stata abrogata ai nostri concentrazioni di lavoro (Figura S2).

Figura 3

Vie di segnalazione distinti regolano l'attivazione del POU3F4HCNR 81675 e 82478 HCNR esaltatori.

Una procedura sperimentale simile è stata eseguita per la HCNR 82.478 enhancer. Abbiamo trattato gli embrioni transgenici con la stessa batteria di segnalare inibitori pathway da 5,5 HPF, 7.5 HPF (figura S3) e 9.5 palco hpf fino a 36-40 HPF (Figura 3H-N e 3P). In questo caso, gli embrioni sono state incubate fino fasi successive quando viene rilevato segnale forte GFP nella vescicola otica. È interessante notare che, RA segnalazione blocco non sopprimere l'attività di HCNR 82.478 enhancer ma invece l'espressione della GFP è stato perso dopo Fgf segnalazione inibizione in tutte le fasi testati. Questi dati indicano che entrambi esaltatori sono regolate indipendentemente e sono attivi sotto l'influenza di percorsi di sviluppo distinti.

Nei topi, POU3F4 lavora in modo cooperativo con il fattore di trascrizione Tbx1 per controllare la crescita cocleare [30] e di espressione mesenchimali di Tbx1 ha dimostrato di essere sotto il controllo di Shh [31].Così, abbiamo deciso di verificare se il HCNR 81.728 potenziatore era anche sotto il controllo di questa via in linee transgeniche zebrafish. Si noti che in zebrafish, l'espressione della GFP viene rilevata principalmente nella vescicola otica, con un po 'di espressione anche a mesenchima (Figura 4A e [18]).Abbiamo trovato che, contrariamente agli altri esaltatori, il HCNR 81.728 enhancer visualizzata una forte riduzione dell'area di espressione GFP (espressa come% del dominio GFP) dopo il blocco di Hh percorso attraverso CyA (Figura 4A-C) suggerendo che probabilmente Tbx1 e POU3F4 condividere gli stessi meccanismi di regolazione.

Figura 4

Il POU3F4 HCNR 81.728 enhancer è regolato da segnalazione Hedgehog.

GFP guidata dal POU3F4 HCNR 81675 enhancer co-localizza con pax2a e Sox2 mRNA

Per avere un quadro più chiaro sui primi eventi durante lo sviluppo dell'orecchio interno, abbiamo poi analizzato più in dettaglio come il primo potenziatore orecchio interno abbiamo descritto, che trova in HCNR 81675, è controllato. In primo luogo, abbiamo confrontato il pattern di espressione promossa da questo enhancer con quella di diversi geni espressi a livello regionale nella vescicola otica. Abbiamo eseguito ibridazione in situ di embrioni di 13, 15 e 18 HPF per pax2a, Sox2, SOX10 e Tbx1 e confrontato i modelli con proteine ​​GFP colorazione in HCNR 81675 animali transgenici. GFP è stato trovato nel dominio otico mediale anche macchiato per pax2a (Figura 5A e D). Sox2, anche se più limitato ad una anteriore e una regione mediale posteriore, è stato trovato anche nello stesso dominio mediale come GFP (Figura 5B e D). Tuttavia, non vi era alcuna correlazione con gli altri geni testati, poiché SOX10 stato espresso tutto vescicola otica (Figura 5C) e Tbx1 è stato espresso in un dominio laterale (dati non mostrati).Questi risultati sono stati ulteriormente confermati da esperimenti di doppia marcatura. Doppia immunoistochimica con un anticorpo anti-GFP e anti-Pax2a mostrato co-localizzazione di entrambe le proteine ​​nello stesso dominio (Figura 5E-E "), mentre anti-GFP immunocolorazione dopo ibridazione in situ per Sox2, SOX10 e Tbx1 trascrizioni in 15 HPF embrioni rivelato solo co-espressione di GFP e Sox2trascrizioni (Figura 5F-F "). No esatta corrispondenza con SOX10 (Figura 5G-G "è stato trovato) e dominiTbx1 di espressione. In effetti, i domini e Tbx1 espressione GFP si escludevano a vicenda (Figura 5H-H ").

Figura 5

Co-localizzazione di Pax2 e Sox2 con GFP guidata dal HCNR 81675 enhancer.

Come già citato, abbiamo scoperto che l'attività enhancer HCNR 81675 è regolata da acido retinoico. Così, per determinare se l'inibizione GFP da DEAB (inibitore dell'acido retinoico) osservato negli embrioni transgenici per la HCNR 81675 enhancer, correlata con abrogazione pax2a e / o l'espressione del geneSox2, ibridazione in situ per questi due geni, nonché per SOX10 e NeuroD è stata eseguita dopo il trattamento DEAB. Infatti, RA inibizione da DEAB guidato per una completa perdita di pax2a eespressione di Sox2 nella vescicola otica, mentre SOX10 e l'espressione NeuroD era simile agli embrioni di controllo trattato con DMSO (Figura 5I-P). Tutti insieme, questi risultati suggeriscono che pax2a e Sox2espressione regolata da segnali RA sarebbe necessaria per la corretta cis-attivazione del HCNR 81675 enhancer nella vescicola otica.

PAX2 e Sox2 sono direttamente reclutati per la POU3F4 HCNR 81675 DNA e sono necessari per la sua funzione

Poiché pax2a e Sox2 sono co-espressi in un dominio simile a quello promosso dalla HCNR 81675 enhancer e inibizione dell'acido retinoico si traduce in perdita di entrambi, GFP e pax2a ed espressioneSox2, abbiamo poi controllato per PAX2 e Sox2 siti di legame nel HCNR 81675 sequenza genomica.Analisi TRANSFAC di 81675 sequenze umane e Xenopus HCNR ha rivelato un elevato numero di siti di legame conservati putativo fattore di trascrizione (TFBS). È interessante notare che per il lavoro qui presentato, un motivo Sox putativi e due PAX2 / 5/8 motivi dove trovò nella sequenza (Figura 6A). Per verificare se le proteine ​​PAX2 e Sox2 sono direttamente legati a questo HCNR 81675 in vivo, abbiamo eseguito test di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP). Primer PCR sono stati progettati per includere la regione di PAX2 e Sox2 siti di legame. Vescicole Otic da stadio 30 a 34 Xenopus embrioni sono stati sezionati e la cromatina è stata immunoprecipitati sia con coniglio anti-Pax2 e gli anticorpi anti-Sox2 coniglio o IgG coniglio come controllo. La figura 6B mostra che il HCNR POU3F4 81675 DNA è stato precipitato l'anti-Pax2 e gli anticorpi anti-Sox2 ma non dai anticorpo isotopica. Inoltre, nessun legame di queste due proteine ​​nel promotore dell'emoglobina Xenopus che manca Pax2 e siti di legame di Sox2 è stato rilevato, confermando la specificità di Pax2 e Sox2 legandosi al endogena Xenopus HCNR 81675 (Figura 6B e risultati della PCR quantitativa mostrato nella Figura 6C).

Figura 6

PAX2 e Sox2 sono direttamente reclutati per la HCNR 81675 DNA.

Infine, per confermare ulteriormente che le proteine ​​PAX2 e Sox2 sono necessari per la funzionalità in vivodel HCNR 81675 enhancer, abbiamo progettato primer contenenti mutazioni nei nucleotidi di base dei siti Sox2 e PAX2 vincolanti (Figura 7A) e abbiamo eseguito mutagenesi sito-specifica di questi siti nel HCNR 81675 sequenza. Linee transgeniche zebrafish stabili sono stati generati con un costrutto contenente il gene GFP sotto il controllo del potenziatore POU3F4 HCNR 81675 ospitare sia la mutazione per la Pax2 o siti di legame di Sox2 così come doppi mutanti. Come mostrato in Figura 7B e 7C, GFP è stata drasticamente ridotta quando entrambi i siti di legame PAX2 e Sox2 sono mutati, ma non nel Pax2 o Sox2 mutanti singoli (dati non mostrati), che indica che entrambe le proteine ​​sono direttamente legati alla POU3F4 HCNR 81675 regione di DNA e necessarie per la sua attività enhancer.

Figura 7

Proteine ​​PAX2 e Sox2 sono necessari per HCNR 81675 attivazione enhancer.

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Ipoacusia è uno dei difetti neurosensoriale più diffusi negli esseri umani e negli ultimi anni molte patologie dell'orecchio umani sono stati collegati a mutazioni in oltre un centinaio di geni differenti [32], [33]. Una delle cause più frequenti di X-linked sordità ereditaria è causata da mutazioni nel locus POU3F4. E 'stato descritto che le mutazioni che portano a X-linked di tipo sordità 3 (DFN3) sindrome non riguardano solo la sequenza codificante POU3F4 [16], ma anche a monte non codificanti regioni, dal momento che molti pazienti umani che mostrano ipoacusia neurosensoriale contengono microdelezioni in una regione 1 Mb 5 'a monte del gene POU3F4. Di conseguenza, noi ed altri abbiamo recentemente identificato diverse POU3F4esaltatori orecchio interno in questa regione genomica [17], [20]. In questo lavoro, noi dimostrare che questi esaltatori hanno attività spazio-temporali distinte e vengono attivati ​​da diverse vie di segnalazione.

Diversi esaltatori POU3F4 auto espressione vescicola otica

Precedente lavoro pubblicato da Ahn e colleghi ha descritto una HCNR umano che dirige specificamente espressione POU3F4 principalmente al mesenchima periotica in transgenici embrioni di topo lacZ [17].Con lo screening per HCNR su una regione di 1 Mb 5 'a monte lla POU3F4 c oding unità diverse altre sequenze conservate evolutivi (da uomo a Xenopus) sono stati identificati [20]. In zebrafish transgenico,Xenopus HCNR 81675 e HCNR 82.478 auto specificamente espressione GFP giornalista all'epitelio otico e in fasi successive alle patch sensoriali dell'orecchio interno. HCNR 81675 dirige l'espressione del gene reporter solo vescicola otica, mentre HCNR 82478 agisce come un potenziatore generale guida POU3F4 ex pressione a tutti i tessuti in cui si esprime, come le vescicole otica, confine mesencefalo-rombencefalo, mesonefro e del midollo spinale. Entrambi i nuovi esaltatori otic sono ad ogni lato del POU3F4 enhancer precedentemente identificato [17]. Così, tre diversi esaltatori di auto espressione POU3F4 al territorio otico indicando che POU3F4 è un fattore di trascrizione cruciale per lo sviluppo dell'orecchio interno e che la sua espressione necessita di una regolamentazione molto precise. Questo è ulteriormente esemplificato dalla sua distinta attività temporale. Nei pesci transgenici stabili, GFP nella vescicola otica si accende a diversi stadi di sviluppo, essendo il potenziatore di HCNR 81675 attivo prima di quello a HCNR 82.478, e questo prima che l'elemento normativo si trova nel HCNR 81728. Inoltre, l'attivazione trascrizionale diretto da il HCNR 82.478 enhancer inizia nei mesonefro, seguita da attività nel perimetro mesencefalo-rombencefalo e, infine, per la vescicola otica. In seguito, a 24-32 hpf GFP non è più rilevata nelle mesonefro e in contrasto viene attivato nel midollo spinale.

E 'stato riportato che ben geni dello sviluppo sono molto strettamente regolati e quindi nella loro loci diversi esaltatori sparsi sono contenuti in giro o nel gene che regolano. Esempi si trovano nel luogo dei Hox e IRXcluster di geni o il gene Sox2 [34], [35]. Nel caso di Sox2, Kondoh e colleghi hanno ben sezionato fuori l'apparato normativo genomica del locus Sox2 pollo. Undici esaltatori sono stati identificati e da quelli, tre e due esaltatori controllano l'espressione di Sox2 nel midollo spinale e placode otica, rispettivamente.

Regolamentazione diversa e l'attivazione temporale di entrambe esaltatori di epitelio otic

Lo sviluppo dell'orecchio interno è molto complessa e molte vie di segnalazione distinti regolarlo. FGF signaling per esempio è usato in tutto lo sviluppo orecchio per controllare i processi distinti, inizialmente è essenziale per l'induzione del primordio otic dall'ectoderma. In embrioni di zebrafish, perdita di FGF3 eFGF8 risultati in completa ablazione della placode otic, mentre in pulcino e topi Fgfs dal mesoendoderm controllare in primo luogo il processo [26] - [29], [36] - [38]. In seguito, diversi Fgfs partecipare interno neurogenesi orecchio, la crescita e la morfogenesi [39] - [43]. Il blocco del Fgf segnalazione da SU5402 ha influenzato la dimensione delle vescicole otic sia enhancer pesci transgenici per il suo ruolo nella crescita e nella formazione placode otic. GFP guidato da HCNR 82.478 ma non da HCNR 81675 è stato soppresso dal inibizione farmacologica della via Fgf in stadio avanzato gastrula. L'attivazione di HCNR 82.478 da FGF signaling probabilmente riflette un ruolo in ritardo di Fgf nello sviluppo sensoriale come molti Fgfs sono espressi in zone sensoriali vertebrati superiori [39], [43]. Al contrario, l'attività 81675 HCNR necessaria l'integrità del percorso RA nelle fasi gastrula ma non nelle fasi successive. RA è sintetizzata nel mesoderma parassiale e influenze romboencefalo e sviluppo orecchio [44] - [46]. In zebrafish, trattamento di embrioni con bassi livelli di RA provoca l'espansione del campo otic, suggerendo che RA ha un ruolo nel limitare il campo per rispondere ai segnali che inducono otic [23]. Inoltre, RA ha anche un'azione positiva per la rigenerazione e la generazione di capelli cellule [47], [48]. RA oltre a regolare lo sviluppo otico direttamente, nelle fasi gastrula è necessario per una corretta patterning rombencefalo e la creazione di espressione FGF romboencefalo [23], [26]. Pertanto, il ruolo del RA sull'attività sul 81675 HCNR potrebbe essere indiretta attraverso l'interruzione dei segnali romboencefalo e l'effetto sinergico di inibire RA FGF percorso a 5.5 HPF. A 9.5 HPF, entrambe le vie sono indipendenti, in accordo con un regolazione indipendente della HCNR 82.478 enhancer da Fgf ma non RA percorso. Notch percorso ha un ruolo cruciale nella specificazione dei domini sensoriali in diverse specie di vertebrati [49], [50], mentre BMP4 regola la generazione dei capelli cellule nei cerotti sensoriali [51], [52]. Per questo motivo, era sorprendente che nessuna delle esaltatori è stata colpita da Notch o inibizione BMP. È interessante notare che, alla fine degli anni potenziatore a HCNR 81.728 è regolato da Hh. Questo sarebbe in accordo con i risultati precedenti in cui è stato mostrato che la segnalazione Shh secreto dalla notocorda e / o piastra è richiesto per la specifica della coclea [53]. Diversi dati suggeriscono che la regolamentazione ritrovata di Hh sul HCNR 81.728 enhancer potrebbe essere mediata da Tbx1 fattore di trascrizione: primo, ci mostrano un regolamento di Hh il potenziatore POU3F4 mesenchimali umane; secondo, i rapporti precedenti nei topi hanno indicato che POU3F4 collabora con Tbx1 durante lo sviluppo del cocleare [30]; terzo, espressionePOU3F4 è ridotta nei mutanti Tbx1 condizionali [54] e, infine, Tbx1 espressione mesenchimale è regolata da Shh [31]. Così, qui mettiamo a disposizione per la prima volta un'analisi complessiva delle vie di segnalazione che impatto sull'espressione POU3F4, agendo separatamente su esaltatori distinti situati in diverse HCNRs.

HCNR 81675 enhancer attività richiede Pax2 e Sox2

GFP guidato da POU3F4 HCNR 81675 co-localizzato con i domini pax2a e espressione di Sox2 nella vescicola otica. Dal momento che i siti di legame Sox e Pax, ma non TBX sono stati trovati nella sequenza di HCNR 81675, abbiamo ipotizzato che sia Pax2 e Sox2 potrebbe essere attivando il potenziatore della linea transgenica zebrafish. Ciò è stato confermato da IP cromatina e mutagenesi sito-specifica dei siti PAX2 e Sox2 vincolanti che hanno mostrato che Pax2 e Sox2 TF sono legati direttamente alla enhancer e regolano l'espressione della GFP in vivo. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che l'espressionePOU3F4 presto diretto dal HCNR 81675 enhancer può essere regolato mediante acido retinoico e Sox2 e fattori di trascrizione Pax2. La nostra analisi mutagenesi del potenziatore HCNR 81675 più il fatto che GFP si trova solo nei domini di pax2a e Sox2 co-espressione, indicano che PAX2 e Sox2 fattori di trascrizione da soli non sono sufficienti per attivare questo enhancer e agire in modo cooperativo sulla genomica locus.Questo sarebbe simile a quello che è stato riportato dalla interazione cooperativa di Pax6 e Sox2 nel-cristallina δ e esaltatori N3 Sox2 [55].

Endogeno POU3F4 gene / POU3F4 è espresso nel confine mesencefalo-rombencefalo, mesonefro e del midollo spinale, così come il mesenchima periotica in Xenopus e embrioni di topo [13] (Figura S4). Varie possibilità potrebbe spiegare la differenza tra l'espressione POU3F4 endogena nel mesenchima periotica e l'attivazione dei esaltatori POU3F4 nell'epitelio otico in zebrafish. In primo luogo, le trascrizioni POU3F4endogeni potrebbero essere presenti nell'epitelio otico a livelli più bassi e non rilevabili mediante ibridazione in situ; in secondo luogo le differenze di sviluppo di espressione potrebbero comparire quando esaltatori sono estratti dal loro contesto genomico. Quest'ultima ipotesi di un regolamento improprio esaltatori esteri è favorita dal fatto che il potenziatore umana descritta da Ahn et al. 2009, quando inserito nel topo [17]spinge espressione lacZ ectopica nel ganglio spirale, oltre all'espressione mesenchimali e in zebrafish (nostro manoscritto e [20]), l'espressione si trova principalmente nella vescicola otica. Inoltre, è stato recentemente ipotizzato che l'espressione genica perfezionare necessario durante l'embriogenesi sarebbe il risultato dell'interazione sinergica di diversi elementi enhancer in maniera combinatoria [56]. A seguito di questa nozione, le grandi regioni genomiche contenenti diversi elementi di regolamentazione dispongano di sottorappresentazione di nucleosomi che suggeriscono una struttura sovra-ordinata genomica [57], [58].

In conclusione, la descrizione dell'attività spazio-temporale di nuovi esaltatori del gene POU3F4 e la loro regolamentazione può contribuire all'ulteriore comprensione della funzione di POU3F4 nell'orecchio interno e le sue implicazioni nella DNF3.

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Figura S1

HCNR 81675 attività non è dipendente da RA, Fgf, Notch, Bmp e Hh a 7,5 e 9,5 HPF. (A-N) GFP si osserva dopo il trattamento di HCRN 81675 embrioni transgenici con inibitori farmacologici di vie di segnalazione a 7.5 HPF (A-G ) e 9.5 HPF (H-N). Orientamento è anteriore sinistra e dorsale fino.

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Figura S2

Abrogazione di diversi geni bersaglio di segnalazione dopo il trattamento con inibitori di segnalazione specifici. (A-J) L'ibridazione in situ per la Fgf, Notch, acido retinoico, BMP e Sonic Hedgehog geni bersaglio pea3 (A-B), NeuroD (C-D), krox20 (E-F), msxC (G-H) e PTC1 (I-J) per confermare l'attività inibitori alle nostre concentrazioni di lavoro. Vista dorsale, l'orientamento è anteriore a sinistra.

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Figura S3

HCNR 82.478 attività dipende da Fgf segnalazione quando vengono trattati a 5,5 e 7,5 HPF. (A-N) GFP è inibita dopo il trattamento di HCRN 82478 embrioni transgenici con 30 micron SU5402 a 5.5 HPF (A-G) e 50 micron SU5402 a 7.5 HPF (H-N). Orientamento è anteriore sinistra e dorsale in tutte le immagini.

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Figura S4

Endogena pattern di espressione di POU3F4 / POU3F4 in Xenopus e topo. (A-B) L'ibridazione in situ per POU3F4 mRNA in embrioni di Xenopus stadio 35 (A) e lo stadio 42 (B). Si noti che l'espressione endogena viene rilevato mesenchima periotica in fase di 42, mentre in fase di 35 POU3F4non è ancora espresso. (C-D ") L'ibridazione in situ per POU3F4 topo mRNA in embrioni di topi di E8.5 stadio (C) e E16.5 (D). Nei topi, anche POU3F4 è espresso a mesenchima otic nelle fasi successive, mostrato in inserti (D ', D "). Sezioni trasversali mostrate in tutti i pannelli.

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Siamo grati ad Anna Bigas e squadra Lluís Espinosa per i protocolli Chip e commenti tecnici e Marta Linares di assistenza tecnica criostato.

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Characterization of New Otic Enhancers of the Pou3f4 Gene Reveal Distinct Signaling Pathway Regulation and Spatio-Temporal Patterns

Àlex Robert-Moreno, Silvia Naranjo, [...], and Berta Alsina

References

1. Kelley MW. Regulation of cell fate in the sensory epithelia of the inner ear. Nat Rev Neurosci. 2006; 7 (11):837–849. [ PubMed ]

2. Torres M, Giraldez F. The development of the vertebrate inner ear.Mech Dev. 1998; 71 (1-2):5–21. [ PubMed ]

3. Bejerano G, Pheasant M, Makunin I, Stephen S, Kent WJ, et al.Ultraconserved elements in the human genome. Science. 2004; 304(5675):1321–1325. [ PubMed ]

4. Sandelin A, Bailey P, Bruce S, Engstrom PG, Klos JM, et al. Arrays of ultraconserved non-coding regions span the loci of key developmental genes in vertebrate genomes. BMC Genomics. 2004; 5 (1):99.[ PMC free article ] [ PubMed ]

5. Gomez-Skarmeta JL, Lenhard B, Becker TS. New technologies, new findings, and new concepts in the study of vertebrate cis-regulatory sequences. Dev Dyn. 2006; 235 (4):870–885. [ PubMed ]

6. Visel A, Bristow J, Pennacchio LA. Enhancer identification through comparative genomics. Semin Cell Dev Biol. 2007; 18 (1):140–152.[ PMC free article ] [ PubMed ]

7. Navratilova P, Becker TS. Genomic regulatory blocks in vertebrates and implications in human disease. Brief Funct Genomic Proteomic.2009; 8 (4):333–342. [ PubMed ]

8. Brown KK, Reiss JA, Crow K, Ferguson HL, Kelly C, et al. Deletion of an enhancer near DLX5 and DLX6 in a family with hearing loss, craniofacial defects, and an inv(7)(q21.3q35). Hum Genet. 2010; 127(1):19–31. [ PMC free article ] [ PubMed ]

9. Vahava O, Morell R, Lynch ED, Weiss S, Kagan ME, et al. Mutation in transcription factor POU4F3 associated with inherited progressive hearing loss in humans. Science. 1998; 279 (5358):1950–1954. [ PubMed ]

10. de Kok YJ, van der Maarel SM, Bitner-Glindzicz M, Huber I, Monaco AP, et al. Association between X-linked mixed deafness and mutations in the POU domain gene POU3F4. Science. 1995; 267 (5198):685–688.[ PubMed ]

11. Le Moine C, Young WS., 3rd RHS2, a POU domain-containing gene, and its expression in developing and adult rat. Proc Natl Acad Sci US A.1992; 89 (8):3285–3289. [ PMC free article ] [ PubMed ]

12. Phippard D, Boyd Y, Reed V, Fisher G, Masson WK, et al. The sex-linked fidget mutation abolishes Brn4/Pou3f4 gene expression in the embryonic inner ear. Hum Mol Genet. 2000; 9 (1):79–85. [ PubMed ]

13. Phippard D, Lu L, Lee D, Saunders JC, Crenshaw EB., 3rd Targeted mutagenesis of the POU-domain gene Brn4/Pou3f4 causes developmental defects in the inner ear. J Neurosci. 1999; 19 (14):5980–5989. [ PubMed ]

14. Bitner-Glindzicz M, Turnpenny P, Hoglund P, Kaariainen H, Sankila EM, et al. Further mutations in brain 4 (POU3F4) clarify the phenotype in the X-linked deafness, DFN3. Hum Mol Genet. 1995; 4 (8):1467–1469.[ PubMed ]

15. de Kok YJ, Merkx GF, van der Maarel SM, Huber I, Malcolm S, et al.A duplication/paracentric inversion associated with familial X-linked deafness (DFN3) suggests the presence of a regulatory element more than 400 kb upstream of the POU3F4 gene. Hum Mol Genet. 1995; 4(11):2145–2150. [ PubMed ]

16. de Kok YJ, Vossenaar ER, Cremers CW, Dahl N, Laporte J, et al.Identification of a hot spot for microdeletions in patients with X-linked deafness type 3 (DFN3) 900 kb proximal to the DFN3 gene POU3F4.Hum Mol Genet. 1996; 5 (9):1229–1235. [ PubMed ]

17. Ahn KJ, Passero F, Jr, Crenshaw EB., 3rd Otic mesenchyme expression of cre recombinase directed by the inner ear enhancer of the Brn4/Pou3f4 gene. Genesis. 2009; 47 (3):137–141. [ PubMed ]

18. Naranjo S, Voesenek K, de la Calle-Mustienes E, Robert-Moreno A, Kokotas H, et al. Multiple enhancers located in a 1-mb region upstream of POU3F4 promote expression during inner ear development and may be required for hearing. Hum Genet. 2010; 128 (4):411–9.[ PMC free article ] [ PubMed ]

19. Cremers FP, Cremers CW, Ropers HH. The ins and outs of X-linked deafness type 3. Adv Otorhinolaryngol. 2000; 56 :184–195. [ PubMed ]

20. Thisse B, Heyer V, Lux A, Alunni V, Degrave A, et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 2004; 77 :505–519.[ PubMed ]

21. Bessa J, Tena JJ, de la Calle-Mustienes E, Fernandez-Minan A, Naranjo S, et al. Zebrafish enhancer detection (ZED) vector: A new tool to facilitate transgenesis and the functional analysis of cis-regulatory regions in zebrafish. Dev Dyn. 2009; 238 (9):2409–2417. [ PubMed ]

22. Aguilera C, Hoya-Arias R, Haegeman G, Espinosa L, Bigas A. Recruitment of IkappaBalpha to the hes1 promoter is associated with transcriptional repression. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101(47):16537–16542. [ PMC free article ] [ PubMed ]

23. Hans S, Westerfield M. Changes in retinoic acid signaling alter otic patterning. Development. 2007; 134 (13):2449–2458. [ PubMed ]

24. Liu W, Oh SH, Kang Yk Y, Li G, Doan TM, et al. Bone morphogenetic protein 4 (BMP4): A regulator of capsule chondrogenesis in the developing mouse inner ear. Dev Dyn. 2003; 226 (3):427–438.[ PubMed ]

25. Chang W, ten Dijke P, Wu DK. BMP pathways are involved in otic capsule formation and epithelial-mesenchymal signaling in the developing chicken inner ear. Dev Biol. 2002; 251 (2):380–394. [ PubMed ]

26. Phillips BT, Bolding K, Riley BB. Zebrafish fgf3 and fgf8 encode redundant functions required for otic placode induction. Dev Biol. 2001;235 (2):351–365. [ PubMed ]

27. Phillips BT, Storch EM, Lekven AC, Riley BB. A direct role for fgf but not wnt in otic placode induction. Development. 2004; 131 (4):923–931. [ PubMed ]

28. Leger S, Brand M. Fgf8 and Fgf3 are required for zebrafish ear placode induction, maintenance and inner ear patterning. Mech Dev.2002; 119 (1):91–108. [ PubMed ]

29. Maroon H, Walshe J, Mahmood R, Kiefer P, Dickson C, Mason I. Fgf3 and Fgf8 are required together for formation of the otic placode and vesicle. Development. 2002; 129 :2099–2108. [ PubMed ]

30. Braunstein EM, Crenshaw EB, 3rd, Morrow BE, Adams JC.Cooperative function of Tbx1 and Brn4 in the periotic mesenchyme is necessary for cochlea formation. J Assoc Res Otolaryngol. 2008; 9(1):33–43. [ PMC free article ] [ PubMed ]

31. Yamagishi H, Maeda J, Hu T, McAnally J, Conway SJ, et al. Tbx1 is regulated by tissue-specific forkhead proteins through a common sonic hedgehog-responsive enhancer. Genes Dev. 2003; 17 (2):269–281.[ PMC free article ] [ PubMed ]

32. Petit C. Genes responsible for human hereditary deafness: Symphony of a thousand. Nat Genet. 1996; 14 (4):385–391. [ PubMed ]

33. Dror AA, Avraham KB. Hearing loss: Mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu Rev Genet. 2009; 43 :411–437.[ PubMed ]

34. Spitz F, Gonzalez F, Peichel C, Vogt TF, Duboule D, et al. Large scale transgenic and cluster deletion analysis of the HoxD complex separate an ancestral regulatory module from evolutionary innovations.Genes Dev. 2001; 15 (17):2209–2214. [ PMC free article ] [ PubMed ]

35. de la Calle-Mustienes E, Feijoo CG, Manzanares M, Tena JJ, Rodriguez-Seguel E, et al. A functional survey of the enhancer activity of conserved non-coding sequences from vertebrate iroquois cluster gene deserts. Genome Res. 2005; 15 (8):1061–1072. [ PMC free article ][ PubMed ]

36. Vendrell V, Carnicero E, Giraldez F, Alonso MT, Schimmang T. Induction of inner ear fate by FGF3. Development. 2000; 127 (10):2011–2019. [ PubMed ]

37. Ladher RK, Anakwe KU, Gurney AL, Schoenwolf GC, Francis-West PH. Identification of synergistic signals initiating inner ear development.Science. 2000; 290 (5498):1965–1967. [ PubMed ]

38. Wright TJ, Mansour SL. Fgf3 and Fgf10 are required for mouse otic placode induction. Development. 2003; 130 (15):3379–3390. [ PubMed ]

39. Alvarez Y, Alonso MT, Vendrell V, Zelarayan LC, Chamero P, et al.Requirements for FGF3 and FGF10 during inner ear formation.Development. 2003; 130 (25):6329–6338. [ PubMed ]

40. Pauley S, Wright TJ, Pirvola U, Ornitz D, Beisel K, et al. Expression and function of FGF10 in mammalian inner ear development. Dev Dyn.2003; 227 (2):203–215. [ PMC free article ] [ PubMed ]

41. Alsina B, Abello G, Ulloa E, Henrique D, Pujades C, et al. FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo. Dev Biol. 2004; 267 (1):119–134. [ PubMed ]

42. Abello G, Khatri S, Radosevic M, Scotting PJ, Giraldez F, et al.Independent regulation of Sox3 and Lmx1b by FGF and BMP signaling influences the neurogenic and non-neurogenic domains in the chick otic placode. Dev Biol. 2010; 339 (1):166–178. [ PubMed ]

43. Pirvola U, Spencer-Dene B, Xing-Qun L, Kettunen P, Thesleff I, et al.FGF/FGFR-2(IIIb) signaling is essential for inner ear morphogenesis. J Neurosci. 2000; 20 (16):6125–6134. [ PubMed ]

44. Begemann G, Schilling TF, Rauch GJ, Geisler R, Ingham PW. The zebrafish neckless mutation reveals a requirement for raldh2 in mesodermal signals that pattern the hindbrain. Development. 2001; 16:3081–3094. [ PubMed ]

45. Dupe V, Ghyselinck NB, Wendling O, Chambon P, Mark M. Key roles of retinoic acid receptors alpha and beta in the patterning of the caudal hindbrain, pharyngeal arches and otocyst in the mouse.Development. 1999; 22 :5051–5059. [ PubMed ]

46. Gale E, Zile M, Maden M. Hindbrain respecification in the retinoid-deficient quail. Mech. Dev. 1999;(1-2):43–54. [ PubMed ]

47. Lefebvre PP, Malgrange B, Staecker H, Moonen G, Van de Water TR.Retinoic acid stimulates regeneration of mammalian auditory hair cells.Science. 1993; 260 (5108):692–695. [ PubMed ]

48. Raz Y, Kelley MW. Effects of retinoid and thyroid receptors during development of the inner ear. Semin Cell Dev Biol. 1997; 8 (3):257–264.[ PubMed ]

49. Daudet N, Lewis J. Two contrasting roles for notch activity in chick inner ear development: Specification of prosensory patches and lateral inhibition of hair-cell differentiation. Development. 2005; 132 (3):541–551. [ PubMed ]

50. Daudet N, Ariza-McNaughton L, Lewis J. Notch signalling is needed to maintain, but not to initiate, the formation of prosensory patches in the chick inner ear. Development. 2007; 134 (12):2369–2378. [ PubMed ]

51. Cole LK, Le Roux I, Nunes F, Laufer E, Lewis J, et al. Sensory organ generation in the chicken inner ear: Contributions of bone morphogenetic protein 4, serrate1, and lunatic fringe. J Comp Neurol. 2000; 424 (3):509–520. [ PubMed ]

52. Pujades C, Kamaid A, Alsina B, Giraldez F. BMP-signaling regulates the generation of hair-cells. Dev Biol. 2006; 292 (1):55–67. [ PubMed ]

53. Riccomagno MM, Martinu L, Mulheisen M, Wu DK, Epstein DJ.Specification of the mammalian cochlea is dependent on sonic hedgehog.Genes Dev. 2002; 16 (18):2365–2378. [ PMC free article ] [ PubMed ]

54. Arnold JS, Braunstein EM, Ohyama T, Groves AK, Adams JC, et al.Tissue-specific roles of Tbx1 in the development of the outer, middle and inner ear, defective in 22q11DS patients. Hum Mol Genet. 2006; 15(10):1629–1639. [ PMC free article ] [ PubMed ]

55. Inoue M, Kamachi Y, Matsunami H, Imada K, Uchikawa M, et al.PAX6 and SOX2-dependent regulation of the Sox2 enhancer N-3 involved in embryonic visual system development. Genes Cells. 2007; 12(9):1049–1061. [ PubMed ]

56. Conte I, Bovolenta P. Comprehensive characterization of the cis-regulatory code responsible for the spatio-temporal expression of olSix3.2 in the developing medaka forebrain. Genome Biol. 2007; 8 (7):R137.[ PMC free article ] [ PubMed ]

57. Guerrero L, Marco-Ferreres R, Serrano AL, Arredondo JJ, Cervera M. Secondary enhancers synergise with primary enhancers to guarantee fine-tuned muscle gene expression. Dev Biol. 2010; 337 (1):16–28.[ PubMed ]

58. Papatsenko D, Goltsev Y, Levine M. Organization of developmental enhancers in the drosophila embryo. Nucleic Acids Res. 2009; 37(17):5665–5677. [ PMC free article ] [ PubMed ]

 

 

 

Caratterizzazioni clinici e molecolari di nuovi POU3F4 mutazioni rivelano che DFN3 è dovuta alla funzione nulla di proteine ​​POU3F4

Hee Keun Lee, Mee Hyun canzone, Myengmo Kang, Jung Tae Lee, Kyoung-Ah Kong, Su-Jin Choi, Kyu Yup Lee, Hanka Venselaar, GertVriend, Won-Sang Lee, Hong-Joon Parco, Taeg Kyu Kwon, Jinwoong bok, Un-Kyung Kim

Genomica fisiologici Pubblicato 1 Nov 2009 Vol.39 n.3,195-201 DOI:10,1152 / physiolgenomics.00100.2009

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Astratto

X-linked di tipo sordità 3 (DFN3), la forma X-linked più diffuso della sordità ereditaria, è causata da mutazioni nel POU3F4 locus, che codifica per un membro della famiglia POU di fattori di trascrizione. Nonostante i numerosi rapporti su valutazioni cliniche ed analisi genetiche che descrivono nuovePOU3F4 mutazioni, poco si sa su come tali mutazioni influenzano le normali funzioni della proteina POU3F4 e causano malformazioni dell'orecchio interno e la sordità. Qui si descrivono tre nuove mutazioni del POU3F4 gene e le loro caratterizzazioni cliniche in tre famiglie coreane che trasportano la sordità segregante al locus DFN3. Le tre mutazioni causano una sostituzione (p.Arg329Pro) o una delezione (p.Ser310del) di residui di aminoacidi altamente conservati nel homeodomain POE o un troncamento che elimina entrambi i domini che legano il DNA (p.Ala116fs). Nel tentativo di comprendere meglio i meccanismi molecolari alla base i loro difetti dell'orecchio interno, abbiamo esaminato il comportamento delle forme normali e mutanti della proteina POU3F4 in C3H / cellule 10T1 / 2 mesodermici. Modellazione proteina così come saggi in vitro hanno dimostrato che queste mutazioni sono dannose per la struttura terziaria della proteina POU3F4 e danneggiare la sua capacità di legare il DNA. Tutte e tre le proteine ​​mutate POU3F4 non è riuscito a transattivare espressione di un gene reporter. Inoltre, tutti e tre non sono riusciti a inibire l'attività trascrizionale di proteine ​​wild-type quando entrambi wild-type e mutante proteine ​​erano coespressi. Poiché la maggior parte delle mutazioni riportate per DFN3 finora sono associati con le regioni che codificano il dominio di legame al DNA POU3F4, i nostri risultati suggeriscono fortemente che la sordità nei pazienti DFN3 è in gran parte dovuto alla funzione nulla di POU3F4.

SORDITÀ CONGENITA È uno dei disturbi sensoriali più comuni negli esseri umani, che colpisce circa uno in 1.000 neonati (24). Più del 50% della perdita dell'udito congenita è dovuta a cause genetiche, e la maggioranza di questi casi ereditari sono nonsyndromic. Mentre la maggior parte della perdita di udito non sindromica genetica è causata da mutazioni nei geni autosomici, casi X-linked sono stimati a comprendere tra l'1 e il 5% di questi(26). Finora, quattro diversi dell'udito nonsyndromic perdita loci X-linked (DFN2, DFN3, DFN4 e DFN6) sono stati mappati, ma il gene-malattia è stato identificato solo per il locus DFN3 (33).

X-linked di tipo sordità 3 (DFN3) rappresenta circa il 50% di tutte le famiglie che portano la perdita di udito non sindromica legata al cromosoma X (26).Le caratteristiche cliniche di DFN3 nei maschi affetti comprendono anomalie temporali delle ossa, la fissazione staffa, e, nella maggior parte dei casi, un tipo misto di perdita dell'udito, che è spesso progressiva (7, 8, 10). Anomalie anatomiche dell'osso temporale rivelato da computerizzata tomografia (CT) comprendono dilatazione della estremità laterale del canale acustico interno (IAC), anormalmente ampia comunicazione tra l'IAC e vano orecchio interno, e, a volte, ipoplasia parziale della coclea (8, 27). Come risultato l'ampliamento del ossea IAC, liquido cerebrospinale può entrare nel vestibolo, che è pensato per essere alla base del fenomeno denunciato "gusher", descritto come sgorga fluido su di rimozione della pedana staffa durante la chirurgia correttiva (8). Le femmine portatrici di una mutazione nel locus DFN3 tipicamente mostrano poca o nessuna perdita dell'udito(26).

Sordità segregare al locus DFN3 è associata a mutazioni del POU3F4 gene(11). POU3F4 appartiene ad una superfamiglia di fattori di trascrizione POU dominio, che sono caratterizzati da un DNA bipartita dominio di legame conservato. Questo dominio è costituito da un dominio specifico per POU e un homeodomain POU, che sono entrambi elica-giro-elica motivi strutturali che influenzano il DNA legame e la specificità (22). Gli studi che utilizzanoPOU3F4 ortologo murino (BRN-4 / POU3F4) hanno dimostrato che la proteina si lega al DNA POU3F4 sul motivo di legame POU-specifici e regola geni bersaglio a valle (22). Espressione dei POU3F4 si trova sostanzialmente in tubo neurale sviluppo durante l'embriogenesi, ma è limitato al proencefalo negli adulti (20, 22). POU3F4 ha anche dimostrato di essere espresso nel muscolo dell'arto, pancreas e orecchio interno (12, 17,28, 29). Durante lo sviluppo dell'orecchio interno, POU3F4 espressione viene rilevata esclusivamente nel tessuto mesenchimale adiacente all'epitelio otica (28, 29). Delezione mirata di POU3F4 in topi provoca anomalie principalmente nelle strutture mesenchima derivato come il limbus a spirale, la scala timpanica, e fibrociti striali della coclea, nonché difetti nell'osso temporale (23, 29). Inoltre, POU3F4 topi knockout mostrano anche malformazioni nei tessuti che normalmente non esprimono POU3F4 quali staffa dell'orecchio medio ed i componenti membranose della coclea, indicando possibili ruoli di POU3F4 in interazioni reciproche tra peri-otic mesenchima e altri tessuti simili come l'epitelio otica (29).

Numerose analisi genetiche di famiglie DFN3 hanno identificato mutazioni nel POU3F4 gene. Questi includono mutazioni, delezioni intragenica parziali o complete del gene, così come delezioni, inversioni, e duplicazioni dellaPOU3F4 regione genomica non comprende il POU3F4 sequenza codificante(8). Caratterizzazioni cliniche di individui affetti e le loro mutazioni specifiche nel POU3F4 sono stati descritti (8). Tuttavia, poco si sa su come tali mutazioni influenzano la normale funzione della proteina POU3F4, che conduce ai caratteristici difetti dell'orecchio interno e la sordità. Né si sa come POU3F4 contribuisce al normale sviluppo dell'orecchio interno.

Qui riportiamo tre nuova mutazioni nel POU3F4 gene identificato in tre famiglie coreane che portano la perdita di udito ereditaria legata al cromosoma X e la caratterizzazione clinica dei membri della famiglia affetti.Inoltre, abbiamo effettuato modellistica molecolare e vari saggi in vitro per comprendere le basi molecolari dei difetti dell'orecchio interno causati da queste mutazioni.

MATERIALI E METODI

Soggetti e valutazioni cliniche.

Due famiglie coreane espongono un modello di ereditarietà legata al cromosoma X e uno coreano famiglia in cui l'eredità X-linked era plausibile sono state accertate presso il Dipartimento di Otorinolaringoiatria, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Corea del Sud. Il probando di ogni famiglia è stato sottoposto a valutazioni cliniche dettagliate, tra cui la storia medica, esami otologici, test audiologici, e TC dell'osso temporale. Le valutazioni cliniche sono state eseguite anche su altri membri delle famiglie, compresi i maschi affetti e delle femmine portatrici. Per il test audiologica, o audiometria tronco cerebrale-evocata risposta (BERA) o audiometria tonale (PTA) è stata effettuata in linea con l'età del paziente, e la media tono puro è stato calcolato con le soglie a 0,5, 1, 2, e 4 kHz. Ad alta risoluzione dell'osso temporale TC è stata eseguita con un 16 di fila multi-detector CT scanner (SOMATOM Sensation 16; Siemens, Erlangen, Germania) utilizzando un protocollo standard osso temporale (18). Contigue 0,7 mm scansioni dell'osso temporale sono state acquisite sul piano assiale e coronale riformattato con incrementi di 1,0 mm. Consenso informato scritto è stato ottenuto da chi partecipa, e questo studio è stato approvato dal Institutional Review Board della Yonsei University College of Medicine.

Le analisi genetiche.

Per le analisi di linkage, DNA genomico da parte delle famiglie sono stati estratti da sangue periferico utilizzando il kit di estrazione del DNA FlexiGene (Qiagen). Essi sono stati genotipizzati con centromerica DXS986 microsatellite marcatore (57.36 cm dal Marshfield Mappa) e telomeric creatore DXS6803 (57,91 cm dal Marshfield Map) che fiancheggiano il locus DFN3 (Xq21.1) con condizioni standard di PCR. La regione codificante delPOU3F4 è stato amplificato per il sequenziamento diretto utilizzando tre set di primer: 1) di primer forward 5'-GTAACCCGTGCTAGCGTCTT-3 'e invertire innesco 5'-GTCGGAGTGATCCTGGCAAT-3', 2) forward primer 5'-CACTCACCGCACACTAACCA-3 'e reverse primer 5'-ACACGCACCACTTCCTTCTC-3 ', 3) forward primer 5'-CTCCATCGAGGTGAGTGTCA-3' e 5'-innesco inverso GGAGCCAGGAATATGAGATCC-3 '. I frammenti di DNA amplificati sono stati sequenziati con un ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (V3.1) e un analizzatore ABI PRISM 3130XL DNA (Applied Biosystems). I dati sono stati analizzati utilizzando ABI Sequencing Analysis (v.5.0) e software Lasergene-SeqMan. Le sequenze risultanti sono stati confrontati con il POU3F4 sequenza dal GenBank (senza adesione. NM_000307).Abbiamo anche sequenziato 70 coreani con udito normale per determinare se le mutazioni sono state presentate nel inalterato popolazione coreana.

Modellistica molecolare.

La struttura cristallina di POU2F1 / Ott-1 è stato utilizzato come modello per costruire un modello di wild-type e le proteine ​​mutanti POU3F4.Modellazione è stata effettuata con il software SE (34) con le impostazioni di parametri standard e protocolli come descritto in precedenza (4, 9). I dettagli del protocollo di modellazione, inclusi i file utilizzati, l'allineamento di sequenze, scelte di parametri, ecc, sono disponibili dahttp://www.cmbi.ru.nl/~hvensela/pou3f4/.

Costruzione di plasmidi.

Per costruire vettori di espressione per wild-type e le proteine ​​POU3F4 mutanti, il full-length open reading frame (ORF) del singolo-esone POU3F4gene è stato amplificato mediante PCR dal DNA genomico di normale o colpiti maschi e sub-clonato nel pcDNA3 vettore di espressione. Le coppie di primer utilizzati erano 5'-atgaattcatggccacagctgcctcg-3 'e 5'-atgcggccgctcagagatcatggcaag-3'. Oligonucleotidi codificanti l'emoagglutinina (HA) sono stati inseriti epitopo al 5 'del POU3F4 ORF.

Immunocitochimica.

C3H10T1 / 2 cellule coltivate su un vetrino da camera LabTek 8 sono state trasfettate con wild-type o mutanti plasmidi di espressione POU3F4, insieme con EGFP plasmide. Quarantotto ore dopo, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 10 min e permeabilizzate dello 0,5% Triton per 10 min a temperatura ambiente. Le cellule sono state poi incubate sequenzialmente con anticorpo monoclonale anti-HA (Zymed) notte a 4 ° C, 568 AlexaFluor anti-topo IgG (Invitrogen) per 1 ora a temperatura ambiente, e 4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole per 5 min a temperatura ambiente.Immagini delle cellule immunostained sono state scattate con microscopio a fluorescenza Olympus IX70 dotato di fotocamera Olympus DP70 (Zeiss) e trattati con Adobe Photoshop (Adobe Systems). Per determinare le percentuali delle cellule che esprimono proteine ​​POU3F4 fuori del nucleo, 100-200 cellule di ogni camera sono state contate manualmente da un ricercatore cieco alle identità campione. Grafici sono state tracciate in base ai numeri raccolti da almeno tre esperimenti indipendenti.

Espressione e purificazione della proteina ricombinante POU3F4.

A glutatione S-transferasi (GST) POU3F4 plasmide ricombinante è stato costruito dal subcloning frammento digerito contenente intere sequenze POU3F4 in pGEX-4T-1 Kpn I / Eco sito RI. Proteine ​​di fusione GST sono stati purificati da rispettivi Escherichia coli estratti BL21 con glutatione-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) secondo le procedure standard(14).

Elettroforetica mobility shift assay.

Le sequenze di oligonucleotidi a doppio filamento utilizzati per rilevare le attività che legano il DNA di POU3F4 sono stati i seguenti: 5'-CAATATGCTAATCAATATGCTAAT-3 '. La miscela di reazione per elettroforetica mobility shift assay (EMSA) conteneva 20 mM Tris · HCl, pH 7,6, 1 mM ditiotreitolo, 2 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10% glicerolo, 1% NP-40, 1 mg poli (di- dC), e le proteine ​​di fusione purificate 2 mg GST-POU3F4 ricombinanti. Oligonucleotidi non marcati sono stati aggiunti nella miscela di reazione e incubate per 10 min a temperatura ambiente. [32 P] è stato aggiunto -labeled DNA sonda (300.000 cpm), e la reazione di legame è stato permesso di proseguire per altri 20 min. Miscele sono stati risolti su gel di poliacrilammide 8% a 150 V per 4 h.Gel sono stati essiccati e sottoposti ad autoradiografia.

Saggi di Trascrizione giornalista.

I plasmidi reporter luciferasi sono stati costruiti inserendo sia la regione a monte promotore umano POU3F4 gene (-482 a +25), o due o tre copie del elemento di associazione POU3F4 (CAATATGCTAAT) nel vettore base pGL2 (21). C3H10T1 / 2 cellule piastrate in piastre da 24 pozzetti sono state cotrasfettate con 300 ng di wild-type o mutanti espressione POU3F4 plasmide, o entrambi plasmidi insieme, 150 ng del reporter luciferasi plasmide, e 20 ng di SV40-renilla plasmide per la trasfezione controllo dell'efficienza. Le cellule transfettate sono state incubate per 24 ore e sottoposte al saggio di luciferasi secondo il protocollo del produttore (Promega). Efficienza di trasfezione in ogni condizione sono stati normalizzati con attività renilla luciferasi, che era sotto il controllo di un promotore SV-40. I risultati sono stati tracciati basata su almeno tre esperimenti indipendenti.

Caratterizzazioni cliniche di famiglie portatrici sordità legata all'X.

Il pedigree di SV08-18 famiglia ha mostrato un tipico pattern di ereditarietà recessiva X-linked di perdita dell'udito (Fig. 1 A). Misurazioni PTA indicato che i probandi di questa famiglia (IV-2, 6 anni) aveva un tipo misto grave di perdita (dell'udito Fig. 1 B). Altri tre anziani maschi affetti (III-3, 36 anni; III-6, 29 anni; III-7, 16 anni) hanno mostrato modelli simili di perdita dell'udito, ma le soglie erano superiori a quella del probando (Fig. 1 B ). Sebbene i dati longitudinali sulla perdita dell'udito non erano disponibili per questi membri maschi della famiglia, perdita di udito più grave mostrato in maschi più anziani soprattutto nella componente neurosensoriale suggerito progressività di ipoacusia, come riportato in precedenza (8). Due femmine portatrici nella famiglia (III-2, III-4) avevano udito normale (Fig. 1 B).

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Fico. 1.

Caratterizzazioni cliniche della SV08-18 famiglia mostrando la perdita di udito ereditaria legata all'X. A: pedigree che mostra un tipico modello di ereditarietà recessiva X-linked di perdita dell'udito. Square (di sesso maschile), cerchio (femmina), ombreggiato (individuo affetto), ridotto (deceduto), cerchio con un punto (mutazione portatore femmina), freccia (i probandi della famiglia). B: audiogrammi del probando (IV-2 , sono mostrati 6 anni), con una grave perdita di udito mista e membri più anziani di sesso maschile con peggio udito.Un vettore femminile (III-4, 32 anni) mostra un udito normale. ○ (a destra) × (a sinistra): soglia di conduzione dell'aria. <(A destra)> (a sinistra): soglia di conduzione ossea. . dBHL, decibel udito livello C: alta risoluzione computer-assistita tomografia (CT) scansioni delle ossa temporali del probando (IV-2) mostra reperti caratteristici di X-linked di tipo sordità 3 (DFN3) come collegamento fistolosa tra il basale turno di coclea e condotto uditivo interno e difettoso modiolus cocleare (a sinistra del pannello, punta di freccia), a differenza del normale aspetto di modiolus cocleare nel normale dell'osso temporale (a destra del pannello, freccia).

La seconda famiglia, SV08-17, ha anche mostrato un tipico pattern di ereditarietà recessiva X-linked di perdita dell'udito. Cinque maschi essere colpiti in tre generazioni (.. Suppl Fig S1) 1 Il probando è stata diagnosticata grave perdita di udito da BERA [soglie > 60 dB NHL (decibel livello udito normale)] 1 mese dopo la nascita ed è in processo di riabilitazione uditivo con gli apparecchi acustici. Un altro maschio affetto nella famiglia (II-4, 23 anni) è stato anche diagnosticato con perdita di udito all'età di 6 anni e ha sviluppato la comunicazione verbale limitato solo con gli apparecchi acustici.

Nella terza famiglia, SV08-21, i probandi è stata diagnosticata con grave perdita di udito da BERA (75 e 90 dB NHL sul lato destro e sinistro, rispettivamente) all'età di 2 anni (Suppl. Fig. S1). Test Audiologic non era disponibile per gli altri membri della famiglia, anche se il prozio del probando aveva sospettato la perdita dell'udito. Poiché il probando e sua madre portava la stessa mutazione, la perdita di udito sembrava essere ereditata in un modello recessivo X-linked in questa famiglia (Fig. 2, dati non mostrati).

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Fico. 2.

Tre nuove mutazioni in POU3F4 locus sono tenuti a influenzare l'interazione proteina-DNA di POU3F4 proteine. A-C: nuove mutazioni identificate in 3 famiglie coreane portando X-linked sordità ereditaria. A: SV08-18 famiglia presenta una mutazione di G a C a nucleotide posizione 986, che si traduce in una conversione di arginina a prolina nella posizione amminoacidica 329 (p.R329P). Questa modifica G-to-C si osserva in tutti i maschi affetti, ed è stato rilevato G / C eterozigosi in tutte le femmine portatrici. B: una delezione di 1 bp identificato nella SV08-17 famiglia provoca uno spostamento telaio di 26 aminoacidi a partire da alanina a la posizione aminoacidica 116, seguito da un troncamento (p.Ala116fs). C: una delezione di nucleotidi 3 dalla posizione 927 al 929 rilevato in SV08-21 famiglia provoca una delezione aminoacido singolo (p.S310del) senza influenzare il telaio codifica . D: mostra schematicamente POU3F4 proteina marcata con le 3 nuove mutazioni identificate in questo studio. POU-specifici e homeodomain sono mostrati come scatole, rispettivamente rosso e blu, e 3 segnali putativi di localizzazione nucleare (NLS) sono indicati come scatole gialle sopra la omeodominio POU-specifico o POU. Le posizioni della mutazione sono indicati con le frecce, e la posizione di cessazione anticipata in mutazione p.Ala116fs è contrassegnato da un asterisco. p.R329P mutazione si trova in una delle putative NLS nella POE omeodominio. E: allineamento della sequenza di amminoacidi del 2 ° e 3 alfa-eliche nelle proteine ​​POU3F4 da diversi eucarioti. Sequenza aminoacidica in questa regione è altamente conservata nei mammiferi. F-H:. Modellistica molecolare del wild-type e le proteine ​​mutanti POU3F4 F: il 3 ° elica nel homeodomain POU illustrato. Il residuo amminoacido verde è Arg329. DNA è mostrato in una rappresentazione ball-and-stick giallo. G: p.R329P mutazione si trova nella terza α-elica della homeodomain POE dovrebbe destabilizzare la struttura elicoidale, che interessano le interazioni proteina-DNA appropriate. Le 2 glutammati che avevano una interazione con arginina persi sono mostrati, come è il asparagina che rende importanti,-specificità relativi contatti DNA. H: nel mutante p.S310del, la mancanza di un residuo amminoacidico causerà uno spostamento di uno posizione per tutti i residui successivi, interrompendo normali interazioni. I dettagli della modellazione sono disponibili anchehttp://www.cmbi.ru.nl/~hvensela/pou3f4/.

Ulteriori TAC eseguite su sei pazienti da tutte le tre famiglie hanno rivelato che i difetti delle ossa temporali erano comparabili per tutti i pazienti esaminati e sono stati quelli tipici di DFN3 (8, 27), tra cui un ampio collegamento fistoloso tra il giro basale della coclea e IAC e difetti nella modiolus cocleare (Fig. 1 C; dati non mostrati). Nessun altro deficit medici o neurologici sono stati identificati in nessuno dei membri della famiglia affetti.

Linkage e mutazione analisi.

Dal momento che le storie di famiglia e valutazioni cliniche di tutti e tre famiglie erano caratteristici per DFN3, abbiamo effettuato analisi di linkage con DXS986 e DXS6803 marcatori microsatelliti. Sordità mostrato linkage al locus DFN3 in queste famiglie (Suppl. Fig. S1), quindi abbiamo cercato mutazioni nel POU3F4 gene nei membri affetti delle famiglie dal direttamente sequenziamento del POU3F4 regione codificante. Sequenza analizza in SV08-18 famiglia rivelato una mutazione puntiforme al nucleotide 986, guanina citosina (c.986 G> C) (Fig. 2 A). Questo cambiamento nucleotide converte un arginina ad una prolina in posizione 329 aminoacidi (p.R329P), che è una delle più residui conservati nella omeodominio POU della proteina POU3F4 (Fig. 2 E).

Sequenza di analisi SV08-17 famiglia identificata una coppia sola base (bp) delezione a nucleotide posizione 346 (c.346delG) (Fig. 2 B). Questa mutazione provoca uno spostamento telaio che codifica 25 nuovi aminoacidi seguiti da premature terminazione della proteina nella posizione aminoacidi 141 (p.Ala116fs). Ciò si traduce in una forma troncata della proteina POU3F4 manca entrambi i domini di legame di DNA (Fig. 2 D).

I membri affetti di SV08-21 famiglia avevano una delezione in-frame di tre nucleotidi (c.927-929delCTC; Fig. 2 C), con conseguente eliminazione della serina amminoacido (p.S310del) nella omeodominio POU (Fig . 2C).

Analisi strutturali del wild-type e le proteine ​​mutanti POU3F4.

La proteina POU3F4 costituito da un NH 2 dominio -Terminal importante per l'attività trascrizionale e due domini che legano il DNA COOH-terminali.Questi domini DNA-legame consistono dominio specifico POU collegate da una regione linker breve al omeodominio POU (13, 20, 22) (Fig. 2 D). Tutte e tre le mutazioni identificate in questo studio sono stati tenuti a influenzare il DNA legame attività della proteina POU3F4, perché colpiscono uno di questi domini. Per esaminare l'effetto delle mutazioni sulla struttura terziaria della proteina POU3F4, modelli molecolari di tipo selvaggio, p.R329P e proteine ​​POU3F4 p.S310del stati costruiti basati sul noto struttura cristallina della proteina POU2F1 / Oct-1 ( 19).

La mutazione p.R329P si trova nel terzo α-elica della homeodomain POE, che è cruciale per interazioni proteina-DNA (Fig. 2, E-G). La sostituzione di prolina per arginina normale in questa posizione dovrebbe essere dannoso per la struttura α-elica dovuta alla destabilizzazione di due importanti sale ponti così come la perdita di una serie di contatti idrofobici. Inoltre, la struttura di aminoacido catena laterale di prolina inserisce tipicamente una curva obbligato che interrompe strutture alfa-elicoidale. Tali disturbi in genere tendono a ridurre massicciamente le interazioni proteina-DNA corretta.

Il residuo serina alla posizione 310 si trova al centro del secondo α-elica della homeodomain POE (Fig. 2 E). Questa elica non è in contatto diretto con il DNA, ma è probabile importante per la struttura complessiva del homeodomain POE. Il modello di omologia suggerisce che la struttura α-elica rimane dopo l'eliminazione del residuo di serina (p.S310del) (Fig. 2 H).Tuttavia, poiché l'assenza di un residuo causerà uno spostamento di una posizione per i successivi residui in questa elica, ciò avrà effetti drammatici sulla stabilità di questa elica perché diverse interazioni idrofobiche andranno persi e un residuo polare diventerà sepolto nel core idrofobico della proteina. Di conseguenza, l'interazione con gli altri eliche è disturbato e la stabilità complessiva del dominio è diminuita, che ridurre fortemente la sua capacità di legame del DNA.

Effetti delle mutazioni POU3F4 sul DNA attività di legame.

Il nostro studio di modellazione ha suggerito che tutte e tre le mutazioni identificate nei pazienti DFN3 sono probabilmente interessando DNA capacità di legame alterando la struttura terziaria del DNA domini di legame della proteina POU3F4. Per verificare questa possibilità, abbiamo condotto EMSA. Vettori di espressione codificanti wild-type e forme mutanti di proteine ​​POU3F4 sono stati costruiti, e le proteine ​​sono state tradotte in vitro. Le capacità DNA-binding della in vitro tradotti e proteine ​​purificate POU3F4 sono stati testati con la sonda oligonucleotide (CAATATGCTAAT) che ha dimostrato di legarsi in modo specifico le proteine ​​POU3F4 murine(21). Come mostrato in Fig. 3 A, wild-type proteine ​​POU3F4 legate fortemente agli oligonucleotidi marcati per formare complessi proteina-DNA (Fig. 3 A, freccia). Specificità dell'interazione proteina-DNA è stata confermata da esperimenti di competizione, in cui l'aggiunta di sonde oligonucleotidiche senza etichetta abolito completamente le interazioni proteina-DNA. In contrasto con il wild-type POU3F4, non rilevabili complessi proteina-DNA sono stati osservati con una qualsiasi delle forme mutanti di POU3F4. Questi risultati indicano che le mutazioni seriamente compromettere la capacità delle proteine ​​POU3F4 di legare sequenze di DNA bersaglio.

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Fico. 3.

Capacità di legame al DNA e localizzazione subcellulare sono stati interrotti dalle mutazioni POU3F4. A: elettroforetico mobility shift assay (EMSA). Proteine ​​POU3F4 wild-type formato un complesso proteina-DNA con gli oligonucleotidi marcati (corsia 3, freccia), che sono stati completamente interrotti con l'aggiunta di oligonucleotidi senza etichetta come concorrenti (corsie 7, 8). Al contrario, p.R329P (corsia 4), ​​p.S310del (corsia 5), o p.A116fs (corsia 6) proteine ​​mutanti non è riuscito a legarsi alle molecole di DNA. B: Analisi immunocitochimica con anticorpi anti-emoagglutinina (HA) di anticorpi wild-type e le proteine ​​mutanti POU3F4 transitoriamente espressi in C3H10T1 / 2 cellule. Mentre le proteine ​​POU3F4 wild-type sono stati per lo più localizzati all'interno del nucleo, la maggior parte delle proteine ​​POU3F4 mutanti sono stati trovati nel nucleo e nel citoplasma. C: grafico quantificare la percentuale di cellule che esprimono proteine ​​POU3F4 fuori del nucleo.

Effetti delle mutazioni POU3F4 sulla localizzazione subcellulare.

Il programma per elaboratore "predictNLS" (5) prevede tre putativi segnale di localizzazione nucleare (NLS) motivi in wild-type POU3F4. Uno di questi si trova nel dominio specifico POU e gli altri due sono in homeodomain POE(Fig. 2 D). La mutazione p.R329P si trova in uno dei motivi NLS nel omeodominio POU, e la mutazione p.S310del si trova tra i due NLS nel homeodomain POU (Fig. 2 D). I troncante mutazione (p.Ala116fs) si traduce in una proteina che non ha nessuno dei motivi NLS a causa della mancanza dei domini di legame del DNA.

Per determinare come queste mutazioni influenzano la localizzazione nucleare delle proteine ​​POU3F4, vettori di espressione codificanti wild-type o proteine ​​mutanti POU3F4 fusa con l'epitopo HA sono state transitoriamente espresse nelle C3H10T1 / 2 celle (30). Abbiamo scelto questa linea cellulare mesenchimali del mouse da POU3F4 si esprime principalmente nel mesenchima circostante l'orecchio interno in via di sviluppo (28). Immunofluorescenza analisi utilizzando anticorpi anti-HA o anti-POU3F4 hanno dimostrato che le proteine ​​POU3F4 wild-type sono stati localizzati esclusivamente nei nuclei delle cellule trasfettate (Fig 3. B, dati non riportati). Al contrario, la maggior parte dei p.R329P o p.Ala116fs POU3F4 proteine, in cui almeno un motivo NLS viene perturbato, sono stati trovati sia nel citoplasma e il nucleo (Fig. 3 B). Anche se ci aspettavamo localizzazione nucleare normale per il mutante p.S310del, che ha conservato tutti e tre i motivi NLS putativi, proteine ​​POU3F4 con questa mutazione anche perso il loro normale localizzazione subcellulare e sono stati trovati in tutte le cellule. Questo mislocalization potrebbe essere dovuto ai cambiamenti nella struttura terziaria della homeodomain POE in cui i domini NLS risiedono.

Effetti delle mutazioni POU3F4 sulle attività trascrizionale.

L'incapacità delle proteine ​​mutanti POU3F4 di legarsi alla sequenza del DNA di destinazione o di localizzare correttamente nel nucleo fortemente suggerito che l'attività trascrizionale delle proteine ​​mutanti POU3F4 inoltre sarebbe gravemente compromessa. Per verificare ciò, abbiamo costruito un plasmide reporter in cui l'espressione del gene luciferasi di lucciola è regolata dal promotore (da -472 a +25 bp) del umana POU3F4 gene, che ha dimostrato di essere regolata direttamente dal POU3F4 proteina stessa(21). Il plasmide reporter è stato cotransfected con il plasmide codificante wild-type o mutanti POU3F4 in C3H10T1 / 2 celle, e la capacità di ciascuna proteina di transattivare POU3F4 il gene reporter è stato valutato misurando l'attività della luciferasi in cellule trasfettate. In questo sistema, proteina wild-type POU3F4 attiva l'espressione del gene reporter quasi triplicato, ma tutte e tre le proteine ​​POU3F4 mutanti omesso di attivare l'espressione genica(Fig. 4 B), indicando che i POU3F4 mutazioni abolire completamente l'attività trascrizionale di proteine ​​POU3F4. Effetti simili sono stati osservati con un altro costrutto reporter di luciferasi cui espressione è sotto il controllo di due o tre copie dell'elemento riconoscimento POU3F4 (CAATATGCTAAT)(21) (dati non mostrati). Avanti, abbiamo testato per vedere se le proteine ​​POU3F4 mutanti potrebbero agire varianti come dominanti-interferenza.Quando entrambi wild-type e una qualsiasi delle proteine ​​POU3F4 mutanti sono stati coexpressed, l'espressione giornalista attivato da wild-type proteina POU3F4 non è stata influenzata, indicando che le proteine ​​POU3F4 mutanti non ha inibito l'attività trascrizionale normale di proteine ​​wild-type (Fig. 4 B). Questi risultati dimostrano che le tre mutazioni identificate nei pazienti DFN3 causano nulli funzionali della proteina POU3F4.

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Fico. 4.

Attività trascrizionale di POU3F4 è stato abolito dal POU3F4 mutazioni. A: attività luciferasi in cellule cotransfected con varie proteine ​​POU3F4 e il reporter costrutto promotore-assente. Nessuna attività luciferasi è stata osservata in cellule che esprimono entrambi wild-type o proteine ​​POU3F4 mutanti. B: attività luciferasi nelle cellule cotransfected con il costrutto giornalista che contiene la regione del promotore POU3F4 (da -472 a +25 bp) e varie forme di proteine ​​POU3F4. Wild-type proteina POU3F4 upregulated l'espressione del gene reporter, mentre nessuna delle proteine ​​mutanti POU3F4 fatto. Cotrasfezione del wild-type e dei mutanti qualsiasi indotti attività luciferasi paragonabili al livello attivato dalla sola wild type. * Significativamente diverso da wild type (t-test, p <0,001); #non significativamente diversi da wild type (P> 0,1).

Abbiamo identificato tre nuova mutazioni nel POU3F4 gene in tre famiglie coreane visualizzazione collegata a X ereditarietà di perdita dell'udito. Due delle mutazioni (p.R329P e p.S310del) si verificano nel omeodominio POU, e la terza mutazione (p.Ala116fs) provoca una terminazione prematura, causando una proteina priva gli interi domini che legano il DNA (Fig. 2).Come i tre mutazioni che abbiamo studiato qui, la maggior parte deiPOU3F4 mutazioni identificate nei pazienti DFN3 specificano cambiamenti di aminoacidi in regioni che codificano i domini che legano il DNA, in maggioranza nel homeodomain POE (8), suggerendo che la perdita del DNA capacità di legame può essere un meccanismo patologico comune a livello molecolare. Infatti, la modellazione di proteine ​​e diverse analisi molecolari dimostrano che i POU3F4 mutazioni gravemente perturbare la capacità di legame al DNA di POU3F4, quindi abolire completamente l'attività trascrizionale della proteina (Figg. 3 e 4). Le proteine ​​POU3F4 mutanti non sono riusciti a inibire l'attività normale trascrizionale di wild-type POU3F4, escludendo la possibilità che le proteine ​​mutanti agiscono varianti come dominanti-interferenza. La sovraespressione delle proteine ​​mutanti in C3H10T1 POU3F4 / 2 cellule non sembrano avere effetti deleteri evidenti sui comportamenti cellulari normali come la proliferazione cellulare o morte cellulare (dati non riportati). Insieme, queste osservazioni suggeriscono che la perdita dell'udito in DFN3 è causata dalla perdita di funzione della proteina POU3F4 anziché dal guadagno di funzioni ectopici di proteine ​​mutanti. Valutazioni cliniche di pazienti DFN3 in questo studio sono in linea con i rapporti già pubblicati che hanno dimostrato una chiara correlazione genotipo-fenotipo tra i diversi tipi di POU3F4 mutazioni e l'orecchio interno(26).

Mutazioni in POU4F3, un altro fattore di trascrizione POU dominio, sono stati implicati in autosomica dominante sordità DFNA15 (32). Simili nostri risultati POU3F4, analisi molecolari POU4F3 mutazioni identificate in pazienti DFNA15 dimostrato che le proteine ​​mutanti POU4F3 mancano attività trascrizionale a causa della perdita di localizzazione nucleare e la capacità di legame al DNA (6, 35). Pertanto, i due fattori di trascrizione POU famiglia condividono un meccanismo patologico molecolare comune, per cui la trascrizione di geni essenziali per lo sviluppo dell'orecchio interno bersaglio è interessato. Coerentemente con la sua espressione nelle cellule dei capelli, POU4F3 ha dimostrato di regolare i geni importanti per la differenziazione delle cellule dei capelli come Gfi1 e LHX3 (15, 16). Allo stesso modo, la perdita di udito in DFN3 da POU3F4 mutazioni è probabilmente associata con la mancanza di espressione del gene bersaglio a valle (s), che svolge un ruolo critico nello sviluppo dell'orecchio interno, soprattutto nel rimodellamento mesenchimali e le interazioni epiteliali-mesenchimali otic. Solo pochi geni bersaglio di POU3F4 sono stati identificati in altri tessuti: gene proglucagon nelle alfa-cellule del pancreas(17), D1A dopamine recettore gene nello striato (25), e umano involucrin gene nell'epidermide (36 ). Tuttavia, poco si sa su bersagli a valle di POU3F4 nel mesenchima peri-otic dove POU3F4 si esprime attivamente(28). I temporali TC osseo dei pazienti DFN3 nonché la POU3F4eliminazione diretta fenotipi dell'orecchio interno suggeriscono che la maggior parte delle malformazioni dell'orecchio interno sono stati trovati nelle strutture derivanti dal mesenchima (23, 28). Pertanto, chiarire gli obiettivi a valle di POU3F4 nel mesenchima peri-otic sarà cruciale per capire come POU3F4 normalmente contribuisce alla patterning mesenchimali nello sviluppo dell'orecchio interno.

Mentre i geni regolati da POU3F4 non sono chiare, studi precedenti forniti suggerimenti su come il POU3F4 gene è regolato nel mesenchima peri-otic durante lo sviluppo dell'orecchio interno. TBX1, un membro della famiglia genica T-box di fattori di trascrizione e conosciuto gene-malattia per la sindrome di DiGeorge, si esprime sia nella epitelio otic e mesenchima peri-otic (1). Gli studi che utilizzano topi knockout tessuto-specifici suggeriscono che Tbx1 espresso nel mesenchima è necessaria per l'espressione mesenchimale di POU3F4 (1), anche se non è chiaro se Tbx1 regola direttamente la mesenchimale POU3F4 espressione. Coerentemente con questo, una interazione genetica tra Tbx1 e POU3F4 ha dimostrato di essere necessari per la formazione cocleare normale (3). È interessante notare che le espressioni di entrambi Tbx1 e POU3F4 nel mesenchima dipendono Sonic hedgehog (31). Così, una via molecolare di Shh-Tbx1-POU3F4 è stato proposto nel mesenchima peri-otic di essere coinvolti nel normale patterning cocleare (2). Ulteriori analisi delle reti molecolari che regolano POU3F4 nonché geni a valle regolati da POU3F4 sono garantiti per produrre una migliore comprensione dei ruoli di POU3F4 in normale patterning orecchio interno, così come il meccanismo causale della DFN3.

Questo lavoro è supportato dalla Corea Sanità Technology R & S del progetto, Ministero della Salute, del Benessere e della famiglia, Repubblica di Corea, Grant A080588 (J. Bok, U.-K. Kim), per un assegno di ricerca di assicurazione sulla vita Filantropia Fondazione, dal Ministero della Pubblica Istruzione coreana attraverso la Corea 21 Brain Project (HK Lee, S.-J. Choi), e dal Centro di Bioinformatica Olanda (H. Venselaar).

Ringraziamo Drs. Dennis T. Drayna e Doris K. Wu per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo anche Jin Ahn per l'assistenza tecnica.

·         ↵ 1 La versione online di questo articolo contiene materiale supplementare.

·         Copyright © 2009 American Physiological Society

RIFERIMENTIREFERENCES