# 601.369ICD +

SORDITA ', AUTOSOMICA DOMINANTE 9; Gene COCH, DFNA9

Fig1

Rapporti fenotipo-Gene

Posizione	Fenotipo	Fenotipo  MIM	Eredità  (in corso)	Fenotipo  chiave di mappatura	Gene / Locus	Gene / Locus  MIM
14q12	Sordità, autosomica dominante 9	601.369	ANNO DOMINI	3	COCH	603.196

Clinica Sinossi

Diagram created by Andrew GNF based on data from Su AI, Wiltshire T, Batalov S, et al (2004

 

 

TESTO

Un simbolo di cancelletto (#) e 'di questa scheda l'evidenza che DFNA9 è causata da mutazione nel gene Cochlin (COCH; 603.196).

Qual è il nome ufficiale del  gene COCH?

Il nome ufficiale di questo gene è "Cochlin."

COCH è il simbolo ufficiale del gene. Il COCH gene è conosciuto anche con altri nomi, elencati di seguito.

Qual è la funzione normale del  gene COCH ?

Il COCH gene fornisce istruzioni per fare una proteina chiamata Cochlin. Questa proteina è abbondante in alcune parti dell'orecchio interno chiamato coclea e sistema vestibolare. La coclea è una struttura a forma di chiocciola che trasforma le vibrazioni sonore in impulsi elettrici ed il sistema vestibolare è costituito da canali piene di liquido che servono per  mantenere l'equilibrio del corpo e l'orientamento nello spazio. Cochlin viene esportata dalle  cellule del sistema cocleare e vestibolare e diventa parte della matrice extracellulare. La matrice extracellulare è un reticolo intricato che si forma nello spazio tra le cellule e fornisce il supporto strutturale. Due regioni della proteina Cochlin, chiamati domini LCCL e VWFA, probabilmente coordinano le interazioni di Cochlin con altre molecole della matrice extracellulare. Queste interazioni sono importanti nella formazione della matrice extracellulare e mantenimento della organizzazione della matrice. Sebbene il ruolo esatto Cochlin rimanga sconosciuta, probabilmente gioca un ruolo nella struttura dell'orecchio interno.

Figura 1.  DFNA9 istopatologia ed  espressione della COCH.

Microfotografia (50) di (un), il giro basale della coclea da un membro inalterato di parenti 1W (59-anni-maschio, sconosciuto il tempo post-mortem), e (b), il Cresta ampollare del canale semicircolare posteriore da un osso controllo umano temporale (81-anno-maschio, postmortem tempo 7 ore) colorata con ematossilina e eosina (H & E). I componenti normali della coclea (a) e le normali costituenti del crista (b sono mostrati). Microfotografie  (50) da due membri con problemi di udito di (c), il giro basale della coclea (parenti 1St, 71 anni, di sesso maschile, il tempo di post-mortem sconosciuto) e (d),  cresta ampollare del canale semicircolare posteriore ( parentado 1W, 86 anni, di sesso femminile, il tempo di post-mortem 18 h) colorate con H & E. C, La lamina spirale ossea, limbus spirale e spirale legamento spettacolo perdita di cellularità con presenza di sostanza acidofile coerente con-mucopolisaccaridi contenente sostanza fondamentale (frecce)  Vi è la perdita di cellule gangliari a spirale e dei loro dendriti che innervano l'organo del Corti. Vi è anche la degenerazione dell'organo del Corti. D, Lo stroma del cresta mostra sostanza colorazione acidofile (frecce) simile a quello trovato nella coclea. C'è perdita di cellule stromali e fibre nervose. L'epitelio sensoriale mostra grave degenerazione delle cellule ciliate, con solo le cellule di supporto rimanente. In situ ibridazione di posthatching giorno coclea pollo (e) e ampollare crista (f) del labirinto vestibolare con Coch antisenso ribosonda. Coch segnale viene rilevato nello stesso . regioni come la sostanza acidofile trovato nella coclea, e macule e creste del labirinto vestibolare dei pazienti DFNA9 e, Coch messaggio è visto in cellule fusiformi lungo il percorso delle fibre del nervo uditivo che penetrano nelle perforata habenula (4, corrispondente alla lamina umana ossea spirale) tra i corpi cellulari gangliari e dell'epitelio sensoriale, nella zona delle piastre cartilaginee dell'arto neurale (1; corrispondente al limbus spirale umano) e l'arto abneural (3; corrispondente al legamento spirale umana) sulla mediale e bordi laterali dell'epitelio sensoriale. Nessun segnale è rilevato nella papilla basilare (2; sensoriali dell'epitelio equivalente al organo umano di Corti), il tegmentum vasculosum (equivalente al vascularis stria umana), o cellule gangliari spirale. Crollo artefatti della vasculosum tegmentum (sopra l'epitelio sensoriale) è visto. F,Coch segnale è rilevato nello stroma sottostante l'epitelio sensoriale e la zona intorno alle fibre nervose vestibolari. Nessun segnale viene rilevato nell'epitelio sensoriale (cellule ciliate e cellule di sostegno).

Descrizione

 DFNA9 è una forma autosomica dominante ad insorgenza nell'età adulta di progressiva ipoacusia neurosensoriale associata a disfunzione vestibolare variabili (riassunto da Robertson et al., 2006).  Il gene COCH è probabilmente il gene più frequentemente coinvolto in casi di sordità non sindromica ad eredità autosomica dominante (DFNA9). Si tratta di una forma progressiva che inizialmente interessa soprattutto le alte frequenze e che comporta anche disturbi dell'equilibrio (vertigini) a causa del coinvolgimento di strutture dell'orecchio interno. La funzione del gene COCH non è ancora del tutto nota, ma nell'orecchio interno delle persone affette sono stati evidenziati depositi di lunghe molecole zuccherine (mucopolisaccaridi), probabile causa della degenerazione delle fibre nervose.

Caratteristiche cliniche

Manolis et al. (1996) riportarono risultati di un'analisi genetica linkage in una famiglia con non sindromica dell'udito neurosensoriale progressiva perdita postlinguale. In questa perdita dell'udito famiglia è stata ereditata come carattere autosomico dominante che inizia a circa 20 anni di età e progredisce alla sordità totale. Manolis et al. (1996) descrissero unici reperti istopatologici osso temporale in questa famiglia. Gli individui affetti sono stati trovati ad avere deposizioni mucopolisaccaridi nei canali del cocleare e nervi vestibolari. Queste deposizioni apparentemente causato strangolamento e la degenerazione delle fibre dendritiche.Manolis et al. (1996) notarono che altri (Khetarpal et al., 1991; Khetarpal, 1993)avevano riferito precedenti valutazioni cliniche di questa famiglia.  

Sulla base dei risultati delle 3 famiglie colpite, compresa la famiglia di Manolis et al.(1996), Robertson et al. (1998) ha descritto la perdita dell'udito come avente il suo esordio tra i 20 ei 30 anni di età. Inizialmente era più profonda alle alte frequenze e visualizzato progressione variabile anacusis da 40 a 50 anni di età. Alcuni pazienti DFNA9 avevano ricevuto gli impianti cocleari e altri utilizzati apparecchi acustici.Uno spettro di clinica coinvolgimento vestibolare, che vanno dalla mancanza di sintomi alla presenza di vertigine, ipofunzione vestibolare come valutato dal elettronistagmografia e istopatologia, era stato trovato. 

Come sono cambiamenti nel  gene COCH correlato alle condizioni di salute?

Sordità sindromica - causata da mutazioni nel COCH gene

Diversi  mutazioni del gene COCH  sono state identificate in individui con una forma di sordità non sindromica (perdita di udito senza segni e sintomi correlati che interessano altre parti del corpo) chiamato DFNA9. Queste sono mutazioni o modificazioni  o eliminazione di un blocco della costruzione di proteine ​​(aminoacidi) usate per fare Cochlin. La maggior parte dei mutazioni del gene COCH segnalate  influenzano il dominio LCCL e probabilmente mettere in pericolo le interazioni di Cochlin con altre molecole nella matrice extracellulare. Una mutazione avviene al di fuori del dominio LCCL e probabilmente colpisce la forma dimensionale 3D di Cochlin.

Non è del tutto chiaro come  le mutazioni del gene COCH  portano alla perdita dell'udito e, in alcuni casi, a problemi di equilibrio e di orientamento. La proteina Cochlin alterato potrebbe non riuscire a entrare a far parte della matrice extracellulare causa di interazioni deteriorate con altre molecole, o può interrompere l'organizzazione della matrice extracellulare. Inquietante la matrice extracellulare può causare cambiamenti strutturali dell'orecchio interno che influenzano l'udito e l'equilibrio.  Cochlin sembra anche faccia  parte dei depositi anomali che si formano nell'orecchio interno delle persone con sordità DFNA9. Questi depositi possono danneggiare i nervi che sono fondamentali per la  funzione uditiva.

 

Mappatura

Con analisi del linkage in una famiglia con perdita dell'udito neurosensoriale progressiva, postlinguale non sindromica, Manolis et al. (1996) hanno dimostrato che la sordità è localizzata nel cromosoma 14q12-q13. Il massimo punteggio lod (6.19 a teta = 0.0) è stato ottenuto con il marcatore D14S121. 

Dove si trova il COCH trova gene?

Località Citogenetica: 14q11.2-q13

Posizione molecolare sul cromosoma 14: coppie di basi 30.874.535 a 30,895,079

(Homo sapiens Annotazione di uscita 107, GRCh38.p2) (NCBI)

Il COCH gene è situato sul ) braccio lungo (q del cromosoma 14 tra le posizioni 13 e 11.2.

Più precisamente, il COCH gene si trova dalla coppia di basi 30.874.535 di paia di basi 30.895.079 sul cromosoma 14.

 

 

Genetica molecolare

Nella famiglia originaria di Manolis et al. (1996) e 2 famiglie supplementari con DFNA9 identificati con le caratteristiche istopatologiche di acidofile sostanza fondamentale nella coclea e vestibolare labirinto, Robertson et al. (1998) descritte mutazioni nel gene separati COCH (603196,0 mila uno - 603.196,0003), che si esprime quasi esclusivamente nell'orecchio interno.  

Fransen et al. (1999) identificarono una mutazione nel gene COCH (P51S,603196.0004) in 1 grande belga e 2 piccole famiglie olandesi con autosomica dominante non sindromica progressiva perdita di udito neurosensoria associata a disfunzione vestibolare. Superiore al 25% dei pazienti affetti da questa mutazione hanno mostrato sintomi aggiuntivi, tra cui episodi di vertigine, acufeni, la pienezza sonora, e la perdita di udito. Fransen et al. (1999) hanno suggerito che il gene COCH può essere uno dei fattori genetici che contribuiscono alla malattia Meniere(156000) e che la possibilità di una mutazione COCH dovrebbe essere considerata in pazienti con malattia di Meniere sintomi.  

Usami et al. (2003) eseguito analisi della mutazione COCH in una popolazione giapponese di 23 pazienti appartenenti a famiglie indipendenti con autosomica dominante deficit uditivo, 4 dei quali hanno riportato sintomi vestibolari, e 20 pazienti affetti da malattie Meniere. Usami et al. (2003) conclusero che mutazioni nel gene COCH sono responsabili di una frazione significativa di pazienti con autosomica perdita dell'udito ereditaria dominante accompagnata da sintomi vestibolari, ma non per la perdita dell'udito dominante senza disfunzioni vestibolari o malattia sporadica Meniere. Essi hanno identificato una nuova mutazione puntiforme nel gene COCH (603196,0006) in un paziente con perdita di udito autosomica dominante e sintomi vestibolari.  

Via et al. (2005) eseguita una scansione dell'intero genoma e analisi di linkage in un pedigree americano con problemi di udito e perdita vestibolari e oculomotori disturbi. Un punteggio lod coppie massima di 7,08 è stato ottenuto con l'indicatore D14S1021, e una mutazione venne identificata in esone 12 del gene COCH(603196,0007) che cosegregate alla disfunzione uditiva. Via et al. (2005) stabilirono che questa era la prima mutazione da segnalare al di fuori del dominio LCCL, che è codificato da esoni 4 e 5. La perdita di udito e disfunzione vestibolare era presente in un maschio di 17 anni, in questa famiglia, il più giovane hanno riferito età di insorgenza di un membro della famiglia DFNA9. 

Yuan et al. (2008) riportarono di una grande famiglia cinese con DFNA9 confermata da analisi genetiche (603196,0008). Età all'insorgenza andava dalla seconda alla quinta decade di vita, e c'era qualche evidenza di anticipazione genetica, anche se i risultati possono essere stati causa di pregiudizio. I membri della famiglia più colpiti (82%) hanno avuto tinnito al momento della comparsa di perdita dell'udito.La perdita dell'udito prima colpito le alte frequenze e poi coinvolto tutte le frequenze. Nel complesso, i pazienti hanno mostrato una audiogramma contorno inclinata verso il basso. Anche se nessuno ha avuto lamentele vestibolari clinici, studi dettagliati hanno mostrato evidenza di difetti sottili.  

Hildebrand et al. (2009) ha riportato un 5-generazioni famiglia americana in cui i membri con non sindromica sordità neurosensoriale e svalutazioni vestibolare, esclusi 2 pensiero per rappresentare fenocopie sordità, ha avuto una mutazione nel gene P51S COCH (603196,0004). Inoltre, 1 membro con la mutazione P51S aveva superiore deiscenza del canale semicircolare bilaterale (SCCD). La famiglia era legato a quelli riportati da {3,2: Fransen et al. (1999, 2001}), che fornisce ulteriori prove di una mutazione fondatore. Hildebrand et al. (2009) raccomandata TC ad alta risoluzione dell'osso temporale in pazienti con sordità DFNA9 legati e screening per COCH in casi sporadici o familiari di canale superiore deiscenza semicircolare.  

In 3 pazienti non imparentati con SCCD e senza storia familiare della malattia o della sordità, Crovetto et al. (2012) mutazioni nel codificanti esoni e confini introne-esone del gene COCH esclusi. 

Patogenesi

In mouse e orecchio interno dell'uomo, Robertson et al. (2006) trovarono che Cochlin immunostaining è stato limitato a tessuti di origine mesodermica; strutture derivati neuroectodermiche ​​chiaramente mancavano dell’espressione Cochlin. Robertson et al. (2006) trovarono che ossa temporali da pazienti con DFNA9 hanno mostrato grandi quantità di depositi acellulare eosinofili Cochlin-immunoreattive contenuti in tutto il legamento spirale, limbus, e lamina spirale ossea. Mice Coch-nulli non hanno mostrato tale materiale, suggerendo che le mutazioni DFNA9 associate producono un effetto dominante negativo. Robertson et al. (2006)suggeriva che l'ostruzione di questi canali in DFNA9 si traduce in un danno neuronale secondario e nella perdita dell'udito. 

Sordità congenita

Circa il 25% degli individui congenitamente sordi hanno una malformazione riconoscibile della capsula otica [37]. Queste anomalie vanno da difetti minori all’ aplasia totale della coclea. Queste malformazioni creano sfide particolari per successo dell’impianto , tra cui le comunicazioni ampiamente brevetti tra lo spazio fluido spinale e la scala perilinfatica tramite un zona cribrosa malformata , causando potenzialmente una perdita di liquido cerebrospinale; giustapposizione anormale del vestibolare apparecchio a coclea, aumentando la possibilità di stimolazione involontaria dei neuroni vestibolari da un impianto cocleare; difficile un un accesso per l'impianto cocleare per assenza della finestra rotonda e / o mal nervo facciale posizionati, e cellule gangliari spirale anomale e diminuite situate in un modiolo rudimentale e nel canale di Rosenthal (fig. 10).

 

Fig. 9. Questo - donna 59 anni  ha subito un ipoacusia progressiva bilaterale neurosensoriale a partire dall'età di 21 anni, secondaria ad una malattia autosomica dominante (DFNA-9). Un audiogramma all'età di 50 anni ha dimostrato una perdita di udito  neurosensoriale da grave a profonda  in questo orecchio destro, con il 0% di discriminazione vocale. Studio patologico dimostrato materiale extracellulare eosinofila infiltrante il legamento spirale (SL) e la lamina spirale ossea (OSL). Anche se c'erano residue cellule gangliari a spirale (SPG) nel canale di Rosenthal, c'era l'atrofia totale dei dendriti periferici della OSL. Cellule ciliate dell'organo del Corti (OC) erano presenti in tutti e tre i giri della coclea. una sezione Midmodiolar. b potere superiore di giro basale (line up b con a).

In sintesi, se non in rari casi, l'istopatologia di grave sordità profonda nell'essere umano si trova soprattutto nella parte interna dell'orecchio. È raro che vi sia totale degenerazione delle cellule gangliari spirale, anche se la distribuzione e il numero totale di queste cellule variano ampiamente.

Istopatologici Cambiamenti nella coclea indotti da Cochlear Impianto

L'inserimento di un array di elettrodi impianto cocleare provoca una quantità variabile di trauma immediato e comporta anche effetti ritardati.

 

Trauma immediata causato da impianti cocleari

A seconda della posizione e le dimensioni della cocleostomia, trauma significativo può verificarsi a membrana basilare e ossea lamina spirale (figg. 11, 12).Spostamento della membrana basilare o frattura-lussazione della spirale ossea

 

Fico. 10. Questo 85-year-old donna soffriva sordità congenita secondaria a grave displasia ossea della coclea e sistema vestibolare. C'erano circa una metà di giri nella coclea rudimentale (C). Non c'erano cellule ciliate. Il modiolus (M) era rudimentale. Ci sono stati, tuttavia, alcune cellule gangliari spirale rimanenti. La scala timpanica (ST) del giro basale è stata marcatamente ridotta nelle dimensioni.

Fico. 10. Questo 85-year-old donna soffriva sordità congenita secondaria a grave displasia ossea della coclea e sistema vestibolare. C'erano circa una metà di giri nella coclea rudimentale (C). Non c'erano cellule ciliate. Il modiolus (M) era rudimentale. Ci sono stati, tuttavia, alcune cellule gangliari spirale rimanenti. La scala timpanica (ST) del giro basale è stata marcatamente ridotta nelle dimensioni.

Fico. 11. Esempio di trauma acuto causato da impianto cocleare in un uomo di 91 anni affetto da sordità neurosensoriale progressiva e profonda bilaterale sottoposti impianto cocleare dell'orecchio sinistro 11 anni prima della morte. L'impianto cocleare pista (CIT) è visibile. In questo giro basale, la matrice dell'impianto era penetrato la spirale legamento (SL) ed è stato circondato da una guaina fibrosa (FS).

Fico. 11. Esempio di trauma acuto causato da impianto cocleare in un uomo di 91 anni affetto da sordità neurosensoriale progressiva e profonda bilaterale sottoposti impianto cocleare dell'orecchio sinistro 11 anni prima della morte. L'impianto cocleare pista (CIT) è visibile. In questo giro basale, la matrice dell'impianto era penetrato la spirale legamento (SL) ed è stato circondato da una guaina fibrosa (FS).

Fico. 12. trauma acuto da impianto cocleare in una donna di 62 anni che ha subito una progressiva perdita di udito e sordità profonda bilaterale come conseguenza di aminoglicosidi ototossicità 5 anni prima dell'impianto. Nella sua impiantati orecchio destro, la matrice di elettrodi (EA) è stata mantenuta in situ.C'è frattura-lussazione della membrana basilare (BM) sulla sinistra a circa 11 mm dalla membrana finestra rotonda, e lo spostamento della membrana basilare (BM) a destra, a circa 18 mm dalla finestra rotonde membrana dalla matrice di elettrodi.

Fico. 12. trauma acuto da impianto cocleare in una donna di 62 anni che ha subito una progressiva perdita di udito e sordità profonda bilaterale come conseguenza di aminoglicosidi ototossicità 5 anni prima dell'impianto. Nella sua impiantati orecchio destro, la matrice di elettrodi (EA) è stata mantenuta in situ.C'è frattura-lussazione della membrana basilare (BM) sulla sinistra a circa 11 mm dalla membrana finestra rotonda, e lo spostamento della membrana basilare (BM) a destra, a circa 18 mm dalla finestra rotonde membrana dalla matrice di elettrodi.

lamina non è raro [38; vedi anche Roland e Wright, questo volume, pp 11-30]. Di tanto in tanto, una rottura della membrana basilare può verificare con il passaggio di un impianto cocleare da scala timpani in vestibuli Scala.

Danni al muro cocleare laterali, in particolare nel tratto ascendente del giro basale, può verificarsi.

 

Modello animale

Makishima et al. (2005) ha rilevato che Coch - / - mice senza Cochlin rilevabile nell'orecchio interno avevano avuto risposte uditiva del tronco encefalico per fare clic e stimoli puri toni indistinguibili da quelli di tipo selvatico topo. Un test lacZ giornalista ha rivelato l'espressione di mRNA in Coch nonsensory regioni epiteliali e stromali della coclea e del labirinto vestibolare nei topi mutanti. Makishima et al.(2005) conclusero che DFNA9 non può essere causato da COCH haploinsufficiency ma da un effetto dominante negativo o il guadagno-di-funzione nelle regioni nonsensory dell'orecchio interno. 

 

RIFERIMENTI

1. Crovetto, MA, Whyte, J., Sarasola, E., Rodriguez, JA, Garcia-Barcina, MJAssenza di mutazioni geniche COCH nei pazienti con deiscenza superiore del canale semicircolare. (Letter) Am. J. Med. Genet. 158A: 251-253, 2012.[PubMed: 22139968, citazioni legate] [Testo completo] 2. Fransen, E., Verstreken, M., Bom, SJH, Lemaire, F., Kemperman, MH, de Kok, YJM, Wuyts, FL, Verhagen, WIM, Huygen, PLM, McGuirt, WT, Smith, RJH, van Maldergem , L., Declau, F., Cremers, CWRJ, van de Heyning, PH, Cremers, FPM, Van Camp, G. Un antenato comune per cocleo COCH connessi (DFNA9) pazienti in Belgio e nei Paesi Bassi che porta la mutazione P51S. J . Med.Genet. 38: 61-65, 2001. [PubMed: 11332404, citazioni legate] [Testo completo] 3. Fransen, E., Verstreken, M., Verhagen, WIM, Wuyts, FL, Huygen, PLM, D'Haese, P., Robertson, NG, Morton, CC, McGuirt, WT, Smith, RJH, Declau, F., Van de Heyning, PH, Van Camp, G. alta prevalenza dei sintomi della malattia di Meniere in tre famiglie con una mutazione nel gene COCH. Hum. Molec.Genet. 8: 1425-1429, 1999. [PubMed: 10400989, citazioni legate] [Testo completo] 4. Hildebrand, MS, Tack, D., De Luca, A., Hur, IA, Van Rybroek, JM, McMordie, SJ, Muilenburg, A., Hoskinson, DP, Van Camp, G., Pensak, ML, Storper, IS, Huygen, PLM, Casavant, TL, Smith, RJH mutazione nel gene COCH è associata con superiore del canale semicircolare deiscenza. Am. J. Med.Genet. 149A: 280-285, 2009. [PubMed: 19161137, immagini, citazioni legate][Testo completo] 5. Khetarpal, U. autosomica dominante perdita dell'udito neurosensoriale: ulteriori risultati dell'osso temporale Arch.. Otolaryng. Testa Collo Surg. 119: 106-108, 1993. [PubMed: 8.417.734, relative citazioni] [Testo completo] 6. Khetarpal, U., Schuknecht, HF, Gacek, RR, Holmes, LB autosomica dominante sordità neurosensoriale: pedigree, risultati audiologici e risultati dell'osso temporale in due famiglie: Arch.. Otolaryng. Testa Collo Surg. 117: 1032-1042, 1991. [PubMed: 1.910.721, relative citazioni] [Testo completo] 7. Makishima, T., Rodriguez, CI, Robertson, NG, Morton, CC, Stewart, CL, Griffith, AJ Targeted distruzione di topo Coch fornisce la prova funzionale che la perdita dell'udito DFNA9 non è un disturbo COCH haploinsufficiency.Hum. Genet. 118: 29-34, 2005. [PubMed: 16078052, citazioni legate] [Testo completo] 8. Manolis, EN, Yandavi, N., Nadol, JB, Jr., Eavey, RD, McKenna, M., Rosenbaum, S., Khetarpal, U., Halpin, C., Mercante, SN, Duyk, GM, MacRae, C., Seidman, CE, Seidman, JG Un gene per autosomica dominante non sindromica sordità neurosensoriale progressiva postlinguale mappa al cromosoma 14q12-13.Hum. Molec. Genet. 5: 1047-1050, 1996. [PubMed: 8.817.345, citazioni legate][Testo completo] 9. Robertson, NG, Cremers, CWRJ, Huygen, PLM, Ikezono, T., Krastiņš, B., Kremer, H., Kuo, SF, Liberman, MC, Mercante, SN, Miller, CE, Nadol, JB, Jr., Sarracino, DA, Verhagen, WIM, Morton, CC Cochlin immunocolorazione di orecchio interno depositi patologici e analisi proteomica in DFNA9 sordità e disfunzione vestibolare. Hum. Molec. Genet. 15: 1071-1085, 2006. [PubMed:16481359, citazioni legate] [Testo completo] 10. Robertson, NG, Lu, L., Heller, S., Mercante, SN, Eavey, RD, McKenna, M., Nadol, JB, Jr., Miyamoto, RT, Linthicum, FH, Jr., Neto, JFL, Hudspeth , AJ, Seidman, CE, Morton, CC, Seidman, JG Le mutazioni in un romanzo cocleare gene causa DFNA9, una sordità non sindromica umano con disfunzione vestibolare. Nature Genet. 20: 299-303, 1998. [PubMed: 9.806.553, relative citazioni] [Testo completo] 11. Via, VA, Kallman, JC, Robertson, NG, Kuo, SF, Morton, CC, Phillips, JO Una nuova mutazione DFNA9 nel dominio vWFA2 di COCH altera un residuo di cisteina conservati e intrachain disolfuro formazione di legami con conseguente perdita progressiva dell'udito e del sito vestibolare specific e disfunzione oculomotoria centrale. Am. J. Med. Genet. 139A: 86-95, 2005.[PubMed: 16261627, citazioni legate] [Testo completo] 12. Usami, S., Takahashi, K., Yuge, I., Ohtsuka, A., Namba, A., Abe, S., Fransen, E., Patthy, L., Otting, G., Van Camp, G. Le mutazioni nel gene COCH sono una causa frequente di disfunzione cocleo-vestibolare progressiva autosomica dominante, ma non di malattia di Meniere. Europ. J. Hum. Genet. 11: 744-478, 2003. [PubMed: 14512963, citazioni legate] [Testo completo] 13. Yuan, HJ, Han, DY, Sole, D., Yan, D., Sole, HJ, Tao, R., Cheng, J., Qin, W., Angeli, S., Ouyang, XM, Yang, SZ, Feng, L., Cao, JY, Feng, GY, Wang, YF, Dai, P., Zhai, SQ, Yang, WY, Egli, L., Liu, mutazioni XZ Novel nel dominio vWFA2 di COCH in due DFNA9 cinese famiglie. (Lettera) Clin. Genet. 73: 391-394, 2008. [PubMed: 18312449, citazioni legate] [Testo completo]

▸ Collaboratori: Cassandra L. Kniffin - aggiornamento: 2012/02/16 Data di creazione: Moyra Smith: 1996/08/09 ▸ Modifica Cronologia: carol: 2015/05/07

 

 

 

 

Cochlin immunocolorazione dell’ orecchio interno depositi patologici e analisi proteomica in DFNA9 sordità e disfunzione vestibolare

1.        Nahid G. Robertson 1, 

2.        Cor WRJ Cremers 2, 

3.        Patrick LM Huygen 2, 

4.        Tetsuo Ikezono 3,

5.        Bryan Krastiņš 4, 

6.        Hannie Kremer 2, 

7.        Sharon F. Kuo 1, 

8.        M. Charles Liberman 5,

9.        Saumil N. Merchant 5, 

10.     Constance E. Miller 5, 

11.     Joseph B. Nadol Jr 5, 

12.     David A. Sarracino 4,

13.     Wim IM Verhagen 6 e 

14.     Cynthia C. Morton 1, ^*

+Autore Affiliazioni

1.  ¹ Dipartimenti di Patologia, Ostetricia, Ginecologia e Biologia della Riproduzione, Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA, Stati Uniti d'America,

2.  ^{2 Dipartimento di} Otorinolaringoiatria, Radboud University Medical Center, Nijmegen, Paesi Bassi,

3.  ³ Dipartimento di Otorinolaringoiatria, Nippon Medical School, Tokyo, Giappone,

4.  ⁴ Harvard Medical School-Partners Healthcare Center di Genetica e Genomica, Cambridge, MA, Stati Uniti d'America,

5.  ⁵ Dipartimento di Otology e Laringologia, Massachusetts Eye and Ear Infirmary, Eaton-Peabody Laboratorio, Harvard Medical School di Boston, MA, USA e

6.  ⁶ Dipartimento di Neurologia, Canisius Wilhelmina Hospital, Nijmegen, Paesi Bassi

1.        ^* A chi corrispondenza deve essere indirizzata a: Dipartimenti di Ostetricia, Ginecologia e Patologia, Brigham and Women Hospital, Harvard Medical School, 77 Avenue Louis Pasteur, NRB 160, Boston, MA 02115, Stati Uniti d'America. Tel: +1 6175254535; Fax: +1 6175254533; E-mail: cmorton @ partners.org

• Ricevuto 25 novembre 2005.
• Accettato 7 FEBBRAIO 2006.

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Sette mutazioni missense e una delezione mutazione in-frame sono stati segnalati nel gene co ​​fattore agulation C h omologia (COCH), causando l'insorgenza nell'età adulta, sordità neurosensoriale progressiva e disturbo vestibolare al locus DFNA9. Prevalenza di mutazioni COCH in tutto il mondo non è nota, in quanto non vi è alcuno sforzo screening sistematico per i disturbi uditivi ad esordio tardivo; Tuttavia, ad oggi, le mutazioniCOCH sono stati trovati in quattro continenti e la possibilità di COCHgiocare un ruolo importante nel presbycusis e disturbi di squilibrio è stato considerato. Cochlin (codificata dal COCH) inoltre è stato indicato come uno dei principali antigeni bersaglio per autoimmune ipoacusia neurosensoriale. In questo rapporto, vi presentiamo l'istopatologia, immunoistochimica e analisi proteomica di tessuti dell'orecchio interno da post mortem DFNA9 campioni ossei temporale di un individuo da un grande olandese affini segregante la mutazione e adulti P51S controlli non affetti umani, e wild-type (+ / + ) e Coch nullo (- / -) topi knock-out.DFNA9 è una malattia dell'orecchio interno con un istopatologia unico che mostra la perdita di cellularità e aggregazione di abbondanti depositi eosinofili acellulare omogenee nel cocleare e labirinti vestibolari, simili a aggregazione proteica in ben noti malattie neurodegenerative. Con immunoistochimica su sezioni di osso temporale DFNA9, abbiamo dimostrato colorazione Cochlin dei caratteristici depositi cocleari e vestibolari, indicando aggregazione Cochlin nelle stesse strutture in cui è normalmente espresso. Analisi proteomica identificato Cochlin come la proteina più abbondante nel mouse e coclee umana. L'espressione di alto livello e stabilità Cochlin nell'orecchio interno, anche in assenza e grave atrofia dei fibrociti che normalmente esprimono COCH, sono mostrati attraverso questi studi e chiarire ulteriormente gli eventi pathobiologic verificano in DFNA9 conseguente perdita e disfunzione vestibolare dell'udito .

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Un gran numero di loci sono stati mappati per sindromica e non sindromica sordità ereditaria, e le mutazioni del gene responsabili di queste patologie vengono continuamente scoperti e caratterizzati (1). Il chiarimento delle funzioni di questi geni e il loro ruolo nella nell'orecchio interno e in patogenesi di udito e disturbi dell'equilibrio sono importanti sforzi in corso.

La sordità malattia autosomica dominante nel locus DFNA9 è stata descritta e gli aspetti clinici ampiamente caratterizzato, mostrando ad insorgenza nell'età adulta, progressiva sordità neurosensoriale e disfunzione vestibolare (2 - 9). Diverse mutazioni missense nel COCH (coagulation fattore C h omologia) gene sono stati trovati inizialmente in tre famiglie negli Stati Uniti, e successivamente in famiglie nei Paesi Bassi, in Belgio e Australia (Tabella 1 e Fig. 1) (10 - 14) . Sono stati riportati - Due casi simplex di un'altra mutazione missense e un in-frame delezione nello stesso dominio di COCH [h omologia (FCH) / l imulus fattore C, c ochlin, lung proteina gestazionale (LCCL) dominio f attore C] in Giappone e Ungheria rispettivamente (15, 16). Un recente rapporto descrive la prima scoperta di una mutazione COCH al di fuori del dominio / LCCL FCH nel fattore A-simile (VWFA) dominio di von Willebrand in un grande gruppo di affini DFNA9 negli Stati (Uniti 9). La prevalenza delle mutazioni COCH in tutto il mondo non è nota, come i test genetici sistematica di perdita di udito in età adulta non è attualmente eseguita.

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Figura 1. Rappresentazione schematica della struttura di amminoacidi corrispondente di COCH umana, che codifica per la proteina Cochlin, mostra un peptide di segnale previsto (SP), seguito da un dominio inizialmente designato come FCH, noto anche come dominio LCCL, seguito da un dominio intermedio (IVd1) e due domini fattore di von Willebrand A-simile (vWFA1 e vWFA2) separati da un dominio intervenendo (ivd2). Sei mutazioni missense familiari (cinque nel dominio FCH / LCCL e uno nel dominio vWFA2) causando DFNA9 sordità e disturbo vestibolare sono indicati da frecce. Le posizioni di tutti i residui di cisteina sono indicati come 'C'. Le tre isoforme conosciute di Cochlin sono rappresentati da linee orizzontali corrispondenti al loro sequenza e designati come p60 (full-length, escludendo la SP) e due isoforme più corte (p44 e p40, entrambi privi del dominio FCH / LCCL).L'anticorpo Cochlin utilizzato in questo studio è stato effettuato nei confronti di un piccolo peptide N-terminale del dominio vWFA1 (residui amminoacidici 163-181), mostrata in figura.Questo anticorpo riconosce tutte e tre le isoforme di Cochlin.

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Tabella 1.

Mutazioni Coch nella DFNA9

COCH è stato isolato inizialmente da approcci sottrattivi organo-specifiche da una libreria di cDNA cocleare feto umano ed è risultato essere espresso ad alti livelli nell'orecchio interno di macchia settentrionale, tessutoibridazione in situ e immunoistochimica (17 - 20). La proteina secreta, Cochlin, è stata rilevata mediante analisi proteomica come la proteina più abbondante nella parte interna dell'orecchio bovina (21). Analisi istopatologiche di ossa temporali DFNA9 colpite nei tre originali famiglie statunitensi hanno rivelato preziose informazioni sulle modifiche apportate in questi endpoint orecchio interno (3, 22). Un risultato sorprendente e unico in queste ossa temporali, che in realtà ha permesso l'identificazione iniziale di alcune di queste famiglie come parentele DFNA9, è la presenza di eosinofili omogenee depositi extracellulari nelle stesse zone, come l'atrofia fibrocyte. Altre patologie neurodegenerative ben caratterizzati con accumulo di proteine ​​aberranti comprendono la malattia di Alzheimer (proteina precursore β-amiloide) (23), malattia di Huntington (huntingtina) (24 - 26) e la malattia di Parkinson (α-sinucleina)(27). Tuttavia, DFNA9 è l'unico noto disturbo dell'orecchio interno che mostra questo tipo di aggregato constatazione patologico firma, mentre i risultati in altre patologie dell'orecchio interno, come idrope endolinfatico, e la degenerazione delle strutture, come l'epitelio sensoriale, le cellule gangliari, legamento a spirale e vascularis stria, si osservano in una varietà di differenti condizioni mostrano perdita dell'udito e disfunzione vestibolare.

I fibrociti cocleari e vestibolari, che sono gravemente atrofizzati in DFNA9, sono cellule che esprimono COCH, ei depositi acellulari omogenei si trovano nelle stesse zone Cochlin immunostaining nel normale dell'orecchio interno (19). Tuttavia, prima di questo rapporto, che non è stato dimostrato che questa sostanza eosinofila nel DFNA9 è il Cochlin anormale che ha precipitato e aggregata o se sia un altro componente dell'orecchio interno, una proteina-Cochlin interagiscono, o qualche altro effetto a valle mutazioni COCH.

Un recente donazione post mortem di un osso temporale, da un individuo dai Paesi Bassi con DFNA9 (COCH P51S mutazione) ha fornito la possibilità di ottenere dati istopatologici aggiuntive per DFNA9. Utilizzando un anticorpo al dominio VWFA di Cochlin, che rileva tutte le isoforme di dimensioni conosciute di Cochlin (Fig. 1), abbiamo intrapreso una caratterizzazione approfondita delle Cochlin immunostaining nel cocleare e labirinti vestibolari. Presentiamo analisi proteomica delle sezioni ossee DFNA9 colpite e inalterati umani adulti temporali, così come di wild-type (+ / +) e Coch nullo (- / -) topo knock-out orecchio interno. Questi studi hanno permesso esame del contenuto dei depositi anomali visti in DFNA9 e fornite informazioni sul ruolo del Cochlin nell'orecchio interno e il meccanismo di pathobiology sottostante DFNA9 da mutazioni COCH.

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Istopatologia di DFNA9 ossa temporali con lo Cochlin mutazione P51S

Alterazioni anatomopatologiche in osso temporale P51S DFNA9 (Fig. 2),sono coerenti con quelli precedentemente riportati per altre famiglie DFNA9 designati 1W (V66G mutazione), 1SU (G88E mutazione) e 1 ° (W117R) (3, 22, 28), suggerendo che la mutazione P51S provoca le stesse modifiche patologiche e agisce attraverso il medesimo meccanismo delle altre mutazioni nel dominio FCH / LCCL di COCH. Una marcata riduzione del numero di fibrociti viene osservato in tutto il legamento a spirale e limbus del condotto cocleare e negli organi vestibolari. Nelle stesse aree di perdita fibrocyte, e atrofia è la-eosinofila colorazione extracellulare sostanza fondamentale DFNA9-caratteristica. I depositi sono particolarmente importanti nelle parti più mediale del legamento sottostante vascularis stria e nella zona di inserimento del legamento nella membrana basilare. Materiale eosinofila è anche presente nella lamina spirale ossea, insieme con la perdita di dendriti in questi canali e nel modiolus.

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Figura 2. H & E macchiato sezioni osso temporale celloidina-embedded da un individuo con DFNA9 da un olandese gruppo di affini segregare la mutazione P51S (67 anni femmina) (B, D, F) eda un controllo inalterato pari età (63 anni, femmina)(A, C, E). Nel dotto cocleare dell'individuo DFNA9 colpite (B, D, × 100), in confronto con il controllo inalterato (A, C, × 100), i risultati più sorprendenti sono la presenza di abbondanti aggregati extracellulari eosinofile tutto il legamento a spirale , spirale limbus e la lamina a spirale ossea, e la perdita significativa e degenerazione fibrociti nel legamento e limbus. In particolare, le parti più mediale del legamento a spirale, sottostanti vascularis stria e la zona di inserimento del legamento nella membrana basilare, risultano maggiormente colpite con presenza di depositi e atrofia fibrocyte. È anche osservato degenerazione dell'organo di Corti e dei processi neurali lamina spirale ossea. Nel ampolla del canale posteriore semicircolare nel labirinto vestibolare (E, F, × 40) cambiamenti patologici, simili a quelli nel condotto cocleare, sono presenti l'ampolla DFNA9 colpite (F) rispetto al controllo inalterato (E). Abbondante deposizione eosinofila è presente nello stroma ampollare DFNA9, con riduzione e atrofia dei fibrociti stromali, nonché degenerazione dell'epitelio sensoriale del crista, e atrofia del nervo ampollare. Inoltre, vi è ispessimento apprezzabile e parziale collasso della parete ampollare, mostrando anche la presenza di aggregati eosinofili.

Cochlin immunostaining in normale dell'orecchio interno

Prima di eseguire immunoistochimica su ossa temporali DFNA9 colpite, abbiamo ottimizzato anti-Cochlin colorazione anticorpale sulla normale mouse e tessuti umani adulti, nonché su un Coch (- / -) topo (29, 30). Nei nostri studi precedenti, abbiamo utilizzato un anticorpo policlonale per l'intero FCH / LCCL e IVd1 dominio di Cochlin (19). Tuttavia, date le isoforme diverse dimensioni di Cochlin rilevati da analisi proteomica e sequenziamento N-terminale (21) (Fig. 1), quattro anticorpi anti piccoli peptidi in diverse regioni del Cochlin sono stati sviluppati e dimostrato da analisi Western Blot per essere specifici per il isoforme che ogni era previsto di riconoscere (31). L'anticorpo anti-Cochlin al dominio vWFA1 reagisce con tutte e tre le isoforme Cochlin noti: p60 (full-length) e P44 e P40 (sia privo del dominio FCH / LCCL) (Fig. 1). Abbiamo scelto questo anticorpo (anti-Cochlin / dominio vWFA1) per i nostri studi, perché avrebbe fornito una rappresentazione più completa della localizzazione Cochlin nei tessuti non colpiti e interessati.

Nel normale coclea topo adulto (Fig. 3), Cochlin immunocolorazione è forte nel legamento a spirale e limbus spirale. Nel legamento, la colorazione è più scuro nella cresta basilare, nei pressi della membrana basilare e più debole della prominenza spirale. Cellule che rivestono canale di Rosenthal ei canali della lamina spirale ossea sono Cochlin-positivi, mentre i corpi cellulari gangliari cocleari ei processi neurali sono Cochlin-negativi. Distinto Cochlin colorazione dei periciti che circondano i vasi sanguigni nel modiolus e in tutto il dotto cocleare si osserva. Al contrario, le aree adiacenti di tessuti circostanti ossei mancano chiaramente Cochlin colorazione. Strutture Cochlin-negativi nel condotto cocleare sono l'organo del Corti, tra cui l'epitelio sensoriale e membrana tettoria, stria vascularis, membrana di Reissner, cellule gangliari cocleari e loro processi neuronali. Nel labirinto vestibolare, creste (Fig. 3 G) mostra colorazione intensa Cochlin nei fibrociti e stroma sottostante dell'epitelio sensoriale e nella parete ampollare. L'epitelio sensoriale, i processi neuronali nello stroma ampollare e l'osso circostante e tessuti connettivi sono tutti Cochlin-negativi.

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Figura 3.L'immunoistochimica su postnatale (5 mesi) (+ / +)(A, C, G) e Coch (- / -) (E)del mouse sezioni dell'orecchio interno con anti-Cochlin.Immunocolorazione (sui pannelli a sinistra) appare come un prodotto di reazione DAB bruno-rossastro; no di contrasto è stata applicata su queste sezioni. Sezioni seriali colorate con H & E sono mostrati in parallelo sui pannelli di destra (B, D, F, H). Nella (+ / +) dotto cocleare (A, × 100; C, × 150), prominente Cochlin immunocolorazione è presente in fibrociti e ECM per tutto il legamento a spirale e limbus spirale.Cellule di rivestimento del canale di Rosenthal (che circonda il ganglio spirale) ed i canali della lamina spirale ossea contengono anche Cochlin, mentre i corpi cellulari gangliari cocleari ei processi neurali sono negativi per Cochlin immunocolorazione.Distinti anelli perivascolari intorno vasi sanguigni nel modiolus e in tutto il dotto cocleare sono macchiati. Al contrario, le aree adiacenti di tessuti circostanti ossei mancano chiaramente Cochlin colorazione. Le strutture della coclea che mostrano l'assenza di espressione Cochlin sono l'organo del Corti, tra cui l'epitelio sensoriale e membrana tettoria (TM), stria vascularis, membrana di Reissner e cellule gangliari a spirale. Il condotto cocleare nel Coch (- / -) mouse (E, × 100) è stato utilizzato come controllo negativo e privo di qualsiasi immunostaining Cochlin, confermando la specificità di questo anticorpo. Nella (/ + +) crista dell'ampolla posteriori nel labirinto vestibolare (G, × 200), intensa colorazione Cochlin si osserva nei fibrociti e stroma sottostante dell'epitelio sensoriale, così come nella parete ampollare. Processi neuronali nello stroma ampollare e l'osso circostante e tessuti connettivi mancanza qualsiasi immunocolorazione. L'epitelio sensoriale è anche completamente privo di qualsiasi colorazione Cochlin, come osservato nel condotto cocleare.

Per confermare la specificità anticorpale, ci immunostained sezioni da unCoch (- / -) topo (29, 30), e non è stata rilevata la colorazione (Fig. 3 E). I controlli negativi con il solo anticorpo secondario mostrano anche senza la colorazione di fondo (dati non riportati). La colorazione intensa per Cochlin nel (+ / +) del mouse orecchio interno corrobora la constatazione di Cochlin mediante analisi proteomica come molto abbondante e stabile proteine ​​nella coclea e organi vestibolari.

Nel controllo inalterato umano adulto orecchio interno (Fig. 4), viene rilevato un modello simile di Cochlin colorazione. Cochlin immunoreattività era prominente tutta la spirale legamento, limbus spirale e all'interno della lamina spirale ossea. Immunocolorazione nel modiolus stata osservata anche intorno ai vasi sanguigni (dati non mostrati). Come nel topo, l'organo del Corti, i corpi cellulari neuronali e assoni centrali e periferiche mancano di espressione Cochlin. I ossee e mesenchimali tessuti esterni circostanti sono anche senza macchia. Nell'adulto umana labirinto vestibolare, creste mostrano anche immunostaining nell'area dei fibrociti stromali e una mancanza di colorazione nell'epitelio sensoriale sovrastante adiacente. Il muro ampollare contiene anche Cochlin, come osservato in sezioni del mouse.

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Figura 4.immunoistochimica su sezioni dell'osso temporale con anti-Cochlin (A, C, E)inalterata umano adulto (75 anni di sesso maschile). No di contrasto è stato utilizzato su queste sezioni;sezioni H & E di serie sono riportati (B, D, F). Nella dotto cocleare (A, C, × 100), Cochlin immunocolorazione è prominente in tutto il legamento a spirale, limbus spirale ei canali della lamina a spirale ossea. Aree adiacenti di tessuti circostanti ossei non sono macchiati con l'anticorpo anti-Cochlin. Strutture della coclea mostrato in questa figura, che mancano di espressione Cochlin, sono l'organo del Corti, tra cui l'epitelio sensoriale e membrana tettoria (TM), stria vascularis e la membrana di Reissner (RM). Alcune di queste strutture mostrano interruzione artefatta come risultato di paraffina di ossa temporali adulti. Nei ampollare posteriori crista del labirinto vestibolare (E, × 200), intenso Cochlin colorazione si osserva nei fibrociti e stroma sottostanti dell'epitelio sensoriale. L'epitelio sensoriale è completamente privo di qualsiasi espressione Cochlin, come è stato osservato nel condotto cocleare.

In entrambi gli organi del mouse e della coclea umana e vestibolari, Cochlin immunostaining è limitato ai tessuti che sono mesodermal di origine; strutture neuroectodermally derivati ​​mancano chiaramente espressione Cochlin. All'interno delle strutture mesodermiche, vi è diffuso e alto livello di espressione di Cochlin in settori come il legamento a spirale, che comprende una grande percentuale della massa totale della coclea membranosa, in accordo con i risultati di elevati livelli di Cochlin mRNA di EST, Northern blot e tessuti nelle analisi di ibridazione in situ(17, 19, 32), e con abbondanza e stabilità di proteine ​​Cochlin come osservato mediante western blot e analisi proteomica (19, 21).

Cochlin immunostaining in orecchio interno DFNA9 colpite

Il pattern Cochlin colorazione nelle DFNA9 temporali sezioni ossee (Fig. 5)è simile a quella in sezioni di controllo non affetti. L'immunocolorazione è forte in tutto il legamento a spirale, a spirale limbus, stroma dei ampollare crista e la parete ampollare. Come controllo negativo, è stata rilevata alcuna colorazione con l'anticorpo secondario solo (dati non mostrati).Non c'è sfondo rilevabile colorazione nei tessuti adiacenti alla parete laterale legamento spirale e tessuti circostanti l'ampolla. Le regioni della lamina spirale ossea normalmente occupata dalla assoni periferici cocleari sono immunopositive per Cochlin, come pure le zone perivascolari nella modiolus. Altre strutture come l'organo del Corti, vestibolari epitelio e stria vascularis sensoriali, che sono Cochlin negativi nei tessuti normali, anche la mancanza di colorazione.

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Figura 5.immunoistochimica su DFNA9 colpiti umano adulto (67 anni femmina) sezioni dell'osso temporale con l'anticorpo anti-Cochlin (A,C, E, G). No di contrasto è stato utilizzato su queste sezioni; sezioni H & E di serie sono riportati (B, D, F,H). Nella dotto cocleare (A, C, × 100), Cochlin immunocolorazione è osservato in tutto il legamento a spirale, limbus spirale ei canali della lamina a spirale ossea. I depositi eosinofili omogenee visto sulle sezioni H & E sono macchiati scuro e in modo uniforme. L'immunocolorazione Cochlin di questo materiale acellulare è prominente nel legamento a spirale, in particolare nella zona di inserimento nella membrana basilare, limbus a spirale e nei canali della lamina a spirale ossea. L'organo del Corti e vascularis stria sono negativi per Cochlin colorazione. Alcuni tessuti macchiati sottostante vascularis stria sembra essere una parte del legamento spirale che è stato rimosso insieme al stria. Aree adiacenti di tessuti ossei circostanti non mostrano alcun immunocolorazione. Nel ampolla posteriore del labirinto vestibolare (E, × 4, G, × 100), Cochlin colorazione dello stroma ampollare contenente i depositi eosinofili si osserva. Il muro crollato ampollare mostrando ispessimento prominente e la deposizione acellulare (F) contiene anche Cochlin (E). L'epitelio sensoriale non mostra espressione Cochlin, come visto nel condotto cocleare sia DFNA9 e controllo inalterato orecchio interno.

Le grandi quantità di depositi acellulare eosinofili contenute in tutta la spirale legamento, limbus e ossea spirale lamina sono scuro e in modo uniforme immunostained con l'anti-Cochlin, ma completamente privi di colorazione non specifica con solo anticorpo secondario. Lo stroma ampollare e la parete, che mostrano la distorsione, il collasso e l'ispessimento, e contengono il materiale acellulare, mostrano anche prominente Cochlin colorazione. Questi risultati sono coerenti con l'idea che Cochlin è intimamente associata con i depositi eosinofili caratteristici della istopatologia dell'osso temporale in DFNA9.

Analisi proteomica nel topo dell'orecchio interno

Analisi proteomica del cocleare e labirinti di vestibolari (+ / +) e Coch (- / -) topi sono stati eseguiti e una lista ridotta del peptide rappresentante le partite sono presentati (Tabella 2). Il numero di peptidi triptici identificate da analisi di spettrometria di massa riflette l'abbondanza relativa di proteine ​​rilevate entro ciascun tessuto con questo metodo. Una scoperta sorprendente è la presenza di Cochlin peptidi come la proteina più abbondante rilevato nella coclea (+ / +) topi. Negli organi vestibolari, Cochlin è la seconda proteina più frequentemente rilevata, con l'albumina essere primario. In entrambi i tessuti, Cochlin è più abbondante di β-emoglobina. I risultati per le altre due proteine, α-tectorin e cheratina 9, sono rappresentativi di proteine ​​strutturali espresse in questi tessuti. La nostra analisi proteomica combina i risultati di quattro frazioni gel dove la digestione e la spettrometria di massa sono stati eseguiti separatamente.Identificazione Cochlin come la proteina più abbondante nel topo lisati dell'orecchio interno corrobora precedente analisi proteomica mediante il metodo alternativo di elettroforesi su gel 2D, rivelando anche Cochlin come la proteina più prevalente in nell'orecchio interno bovina (21). Come controllo negativo, abbiamo studiato il Coch (- / -) del mouse. Nessun peptidi Cochlin stati rilevati sia in tessuti cocleari o vestibolari, confermando l'assenza di proteine ​​Cochlin come indicato anche dal nostro immunoistochimica e da precedenti occidentale blot (30).

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Tabella 2.

Abbondanza relativa di peptidi dell'orecchio interno in wild-type Coch + / + e - / - mice

In (+ / +) topo coclea, un totale di 123 Cochlin peptidi triptici rappresentano 38 peptidi unici vengono rilevati, che vanno da 7 a 35 residui amminoacidici ciascuno. La copertura peptide esteso per Cochlin è stata osservata (Fig. 6) in tutti i domini della proteina full-length (escluso il peptide segnale). In concomitanza con rilevamento di Cochlin come altamente abbondante e stabile proteine ​​nella cocleare e organi vestibolari, e la sua espressione piuttosto limitato ad un livello elevato nell'orecchio interno, è interessante notare che diversi studi hanno implicato Cochlin come antigene bersaglio per autoimmune ipoacusia neurosensoriale via sia immunoglobuline e meccanismi delle cellule T-mediata. Sono stati rilevati livelli sierici di immunoglobuline anti-Cochlin in un numero di pazienti con perdita dell'udito autoimmune (33, 34).Inoltre, Cochlin ha dimostrato di co-immunoprecipitato con colina transporter-like protein 2 come bersagli di perdita dell'udito anticorpi indotta (35, 36). Gli studi hanno anche dimostrato sperimentalmente indotta CD4 + T-cellule-mediata perdita di udito autoimmune con Cochlin come antigene bersaglio (37, 38). Inoltre, recenti indagini hanno rivelato frequenze significativamente più elevati di circolanti cellule T specifiche per Cochlin così come elevati titoli anticorpali siero specifico-Cochlin in individui con autoimmune perdita dell'udito neurosensoriale, rispetto ai controlli di pari età non affetti (39). Queste relazioni implicano Cochlin come un importante obiettivo orecchio interno antigene sia anticorpi e cellule T-mediata perdita dell'udito autoimmune.

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Figura 6. Amino sequenza di acido di Cochlin umana e mouse, mostrando la distribuzione di digerire frammenti triptici identificati mediante spettrometria di massa dal tessuto cocleare. I domini di Cochlin sono sottolineati ed etichettati (FCH / LCCL in rosso, vWFA1 e vWFA2 in blu), così come la SP, spaccati in Cochlin maturo e quindi non rilevato tra frammenti triptici. Residui di amminoacidi identici tra uomo e topo sono indicati da un punto. La copertura peptide Cochlin, come si trova nella nostra analisi proteomica, da sezioni umani affetti fissati in formalina e inclusi in paraffina temporali osso è evidenziato in giallo e da topo fresco intero tessuto cocleare è evidenziata in verde.

Analisi proteomica di umano adulto ossa non affetti e DFNA9-colpite e temporali

Perché l'unico materiale disponibile dai campioni umani DFNA9 colpiti e non colpiti è fissato in formalina, ossa temporali inclusi in paraffina, abbiamo dovuto adottare un approccio diverso rispetto a quello utilizzato nel topo. Così, l'analisi proteomica è stata eseguita su proteine ​​estratte dalle sezioni in paraffina 8-micron, mentre sono tipicamente utilizzati lisati tissutali intero freschi o tessuti congelati.

Nel campione dell'osso temporale inalterato umano adulto, Cochlin è anche la proteina più abbondante rilevato mediante spettrometria di massa, come è avvenuto nel topo utilizzando lisati freschi cocleari. Un totale di 66 peptidi Cochlin, rappresentando 17 peptidi unici, vengono rilevati (Tabella 3), che vanno da 10 a 35 aminoacidi residui ciascuna.Peptidi Cochlin identificati nel campione umano sono rappresentative tutta la proteina in tutti i domini di Cochlin, anche se la copertura peptide non è completo come quello trovato nel campione mouse (Fig. 6). Questo non è sorprendente dato che l'estrazione del peptide da sezioni in paraffina fissati in formalina di archiviazione (40) è molto più difficile che da fresche lisati tissutali totali. Ciononostante, questi risultati indicano che Cochlin è anche un componente diffusa e stabile dell'orecchio interno umano adulto.

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Tabella 3.

Proteine ​​identificate da DFNA9-affetti e non affetti adulti ossa temporali umane

Un elenco completo alfabetico di tutte le proteine ​​rilevate dall'analisi proteomica delle sezioni dell'osso temporale umano adulto è presentato nella Tabella 3. Le principali classi di proteine ​​trovate sono componenti extracellulari e strutturali della coclea, Cochlin essendo il primario. Molte delle proteine ​​sono noti per essere espresso nel legamento spirale, che comprende una quantità preponderante della massa totale cocleare. Tipi di collagene I, II, IX e XI, che sono anche in abbondanza rilevati nella nostra analisi, sono molto rappresentative delle componenti noti e stabili di tessuto cocleare e coinvolti in entrambi i tipi non sindromiche e sindromiche di perdita dell'udito (1). Altre proteine ​​spesso rappresentate nella nostra analisi sono quelli che comprende elementi del citoscheletro, come cheratina, β-actina e tubulina, che sono noti anche per essere espresso nella coclea. Un totale di 13 peptidi unici sono identificati, che rappresentano cinque cheratine distinte. Il filamento intermedio, vimentina, è la seconda proteina più prevalente rilevato nella nostra analisi (29 partite peptidici, riflettendo 17 peptidi unici), seguito da collagene di tipo II, l'alfa 1 (11 partite peptidici, che rappresentano due peptidi unici).Localizzazione immunoistochimica di vimentina nell'orecchio interno gerbillo mostra l'espressione ad alto livello di questa proteina in maggior parte delle cellule del tessuto connettivo e in vari tipi di cellule epiteliali, compresi alcuni tipi di organi di cellule di supporto Corti (41).

La nostra analisi proteomica di sezioni di tessuto fissate in formalina e inclusi in paraffina adulti umani ha alcune limitazioni nel numero e la complessità delle proteine ​​cocleari identificato, probabilmente a causa della inaccessibilità e la possibile degradazione delle proteine ​​durante il processo di estrazione di quantità molto piccole di tessuto in sezioni di paraffina di 8 micron. Tuttavia, anche con queste limitazioni, sono stati rilevati molte proteine ​​rappresentative. Cochlin è la più diffusa, mostrando oltre il doppio dei peptidi rilevati come vimentina e riflette la sua alta espressione e la stabilità anche dopo il protocollo di trattamento e l'estrazione dai tessuti fissi ed embedded.

Nell'analisi proteomica delle sezioni dell'osso temporale DFNA9 colpite (Tabella 3), sono sostanzialmente meno proteine ​​identificate, e anche meno corrispondenze peptide per ogni proteina. Tuttavia, vi è una significativa sovrapposizione nelle proteine ​​che sono stati identificati nei campioni DFNA9 colpiti e non colpiti. Oltre a componenti del sangue, l'albumina e a- e beta-globine, principali proteine ​​che si trovano nell'osso temporale DFNA9 colpiti (e anche presenti nel campione inalterata) sono Cochlin, tipi di collagene I Alpha 1 e alfa 2, e cheratine 1 e 2a. Un confronto quantitativo di proteine ​​attraverso il DFNA9 colpite e campioni costanti non possono essere effettuate in quanto i due campioni variavano notevolmente in complessità e il numero di peptide totale partite per ogni proteina, probabilmente a causa della maggiore difficoltà di estrazione e solubilità delle proteine ​​nel sezioni DFNA9 che era evidente durante il trattamento dei campioni (anche discusso sotto). Per ogni proteina identificata nel campione DFNA9, il numero totale di peptide corrisponde varia da 1 a 3, mentre nel campione inalterato stati trovati 1 a 66 corrispondenze. Ad esempio, nel campione inalterato, il numero totale di partite peptidici sono 66 per Cochlin, cinque per la cheratina 1 e due per il collagene di tipo I alfa 2; corrispondenti partite peptide nel campione DFNA9 colpite sono tre, uno e due, rispettivamente. Il numero di peptidi Cochlin trovato nel campione DFNA9 è superiore o pari a quella di qualsiasi altra proteina. Peptidi Cochlin individuati nel campione DFNA9 sono sia dal N- e le porzioni C-terminale del Cochlin spanning aminoacidi residui da 81 a 91, nel dominio e aminoacidi FCH / LCCL residui 526-539 nel dominio vWFA2.

Un fattore importante nella identificazione di proteine ​​è stata che la composizione del tessuto di campioni ossei temporali DFNA9 colpite ha presentato una sfida per l'estrazione di proteine ​​totali a causa della insolubilità relativa di questi campioni. Gran parte di questo campione è rimasto come aggregati insolubili durante il protocollo di estrazione.Pertanto, un gran numero di proteine ​​sono stati probabilmente non solubilizzato o estratta, rendendoli inaccessibili per l'analisi di spettrometria di massa e conseguente minore complessità e del numero di proteine ​​totali, nonché un numero complessivo inferiore di peptidi. La difficoltà di estrazione e la solubilità delle proteine ​​dalle sezioni DFNA9 colpiti forse non è sorprendente dato l'osservazione delle grandi quantità di DFNA9 aggregati eosinofili nel legamento spirale e limbus al microscopio ottico. Tuttavia, Cochlin viene rilevato nel tessuto DFNA9 colpite almeno tutte le volte che altre proteine ​​importanti come collagene, cheratina e componenti del sangue albumina e globine. Rilevamento Cochlin nell'osso temporale DFNA9 come una delle proteine ​​primarie identificate mediante analisi proteomica suggerisce la stabilità Cochlin aggregati anche in assenza e grave degenerazione dei fibrociti che normalmente esprimono COCH e corrobora nostra scoperta immunoistochimica di intensa Cochlin colorazione della depositi abbondanti presenti nell'orecchio interno DFNA9 colpite.

Analisi RT-PCR

Per valutare se l'allele COCH mutante in individui con le P51S mutazione (nucleotide C207T) mostra espressione stabile del COCH trascritto mutante, inversa reazione a catena di trascrizione-polimerasi (RT-PCR) è stata effettuata su RNA da virus di Epstein-Barr (EBV) - linee di cellule trasformate. Una banda distinta della dimensione attesa è stato ottenuto (dati non mostrati) utilizzando primer fiancheggianti la mutazione.Cromatografi sequenza mostrano altezze approssimativamente uguali sia per i normali e mutati coppie di basi nel campione DFNA9 colpite eterozigote e un unico picco di ampiezza superiore per la coppia di basi normale nel campione inalterato.

Questi risultati suggeriscono che il trascritto mutante COCH mostra espressione stabile in pazienti P51S DFNA9 e non è sottoposto a degradazione. Dato che questo mutazione missenso e tutte le altre mutazioni COCH noti (sette missense e un in-frame delezione) non causano alcun scioglimento anticipato o troncamento della sequenza proteica previsto, si può prevedere che l'allele mutante avrebbe mostrato espressione stabile. Tuttavia, alcune mutazioni missenso producono trascritti o proteine ​​instabili, che sono sottoposti alla degradazione da meccanismi cellulari e efficacemente provocano mancanza di una proteina funzionale. Nel caso di DFNA9, rilevamento stabile del trascritto mutanteCOCH è coerente con l'ipotesi di un negativamente dominante effetto della mutazione in DFNA9 patologia piuttosto che haploinsufficiency di Cochlin.

Cochlin deposizione in DFNA9

I nostri studi precedenti hanno dimostrato Cochlin essere secreto e glicosilata in cellule di mammifero trasfettate con full-length COCH cDNA(42). Come glicoproteina extracellulare, con le / LCCL e VWFA domini FCH, Cochlin rischia di legarsi a, o interagire con altri componenti cellulari come proteine ​​extracellulari, glicoproteine ​​e proteoglicani. Tali interazioni sono stati indicati per altre proteine ​​contenenti questi tipi di domini (43 - 47). I nostri studi di microscopia luce delle sezioni DFNA9 hanno identificato il materiale eosinofila prominente come un materiale omogeneo extracellulare acellulare. Colorazione Movats pentachrome suggerisce che questo materiale può contenere una sostanza mucopolysaccharide simile(3). Esame al microscopio elettronico di sezioni DNFA9 orecchio interno mostra questi depositi extracellulari di essere altamente ramificata, disordine, sostanza microfibrillare, con granuli di glicosaminoglicani simili sparse (48). Queste osservazioni sono coerenti con la nostra scoperta di Cochlin immunocolorazione della sostanza fondamentale eosinofila, suggerendo che questi aggregati contengono extracellulare depositati Cochlin. È anche possibile che altre proteine ​​associate con Cochlin possono essere presenti e che la natura di queste interazioni è alterata a causa della presenza di Cochlin mutato.

In termini di meccanismo reale delle mutazioni missenso conducono al misfolding e aggregazione di Cochlin, diversi studi in vitro sono stati condotti per indagare questa possibilità. Gli studi iniziali del dominio FCH / LCCL di Cochlin nelle cellule batteriche hanno mostrato misfolding di questo dominio dovuti a diverse dei noti mutazioni che causano malattie e le precipitazioni del mutante FCH / LCCL peptide durante il processo di piegatura (49). I nostri trasfezioni transitorie di full-length COCH con molte delle mutazioni ereditarie non hanno evidenziato differenze di secrezione o apparenti livelli steady-state di Cochlin (9, 42). Un altro studio confermato questi risultati e riportato differenze Cochlin deposizione nella matrice extracellulare (ECM) delle cellule in coltura, suggerendo alterata integrazione Cochlin mutato nella matrice (50).Tuttavia, un avvertimento di studi in vitro è la mancanza dell'ambiente extracellulare appropriata dell'orecchio interno. Inoltre, l'insorgenza tardiva e progressività di DFNA9 suggerisce che gli effetti di mutanti Cochlin come aggregazione o alterata interazione con altri componenti ECM potrebbe essere un processo cumulativo. Un modello di topo DFNA9 sarebbe meglio affrontare a lungo termine e cambiamenti progressivi nell'orecchio interno a seguito di Coch mutazioni e tale modello è attualmente in corso di valutazione nel nostro laboratorio.

Possibile eziologia e la patogenesi della DFNA9

Cochlin immunocolorazione di aggregati eosinofile in DFNA9 e la grave atrofia dei fibrociti nelle stesse zone puntano verso i siti primari dove cambiamenti patologici potrebbero hanno avviato a seguito di mutazioniCOCH. Altre osservazioni nelle sezioni post mortem DFNA9 sono la degenerazione neuronale neuroepiteliale e nella parte interna dell'orecchio. Poiché Cochlin non è espresso in queste strutture neuroectodermici, è probabile che questi cambiamenti sono secondari a quelli nei tessuti mesodermici. La riduzione notevole e la degenerazione di fibrociti e la sostituzione da aggregati in tutto il legamento a spirale e limbus spirale sono negli stessi siti come i percorsi di K + riciclaggio da cellule epiteliali dell'organo del Corti nel vano dei media Scala endolinfatico (51), indicando una rottura dell'integrità della rete di giunzioni che esiste normalmente tra queste cellule e svolge un ruolo critico nella omeostasi di ioni necessari per il corretto funzionamento delle cellule dei capelli. Pertanto, una perturbazione di orecchio interno equilibrio ionico probabile si verifica in DFNA9 a causa della mancanza di fibrociti e presenza di depositi in tutte le zone critiche per K + riciclaggio.

Un'altra osservazione in entrambe le orecchie interne non interessate e DFNA9 è Cochlin immunocolorazione tutta la lamina spirale ossea e nelle aree modiolar neuroni e loro processi circostanti, ma non nei corpi o processi cellulari neuronali. La rilevazione di depositi Cochlin all'interno di questi canali neurali suggerisce che l'ostruzione di questi canali e danno neuronale può anche essere che si verificano a seguito di aggregati mutanti Cochlin.

Una scoperta intrigante è Immunostaining aree perivascolari nella modiolus e in tutto il dotto cocleare. Tale constatazione suggerisce la possibilità che Cochlin deposizione in aggregati perivascolari di organi al di fuori dell'orecchio interno è implicato in alta prevalenza di disturbi vascolari che è stato trovato in alcune parentele P51S DFNA9 (4), tra cui quello a cui l'attuale 67 anni -vecchio individuale femminile apparteneva(52, 53). Queste osservazioni giustificano ulteriori studi di espressione Cochlin dei vasi sanguigni extralabyrinthine.

Un'altra osservazione interessante è la mancanza di qualsiasi altro reperto istopatologico simili tra le ossa DFNA9 colpite temporali e quelle di Coch(- / -) topo (a ~ 5 mesi di età) (30) (Fig 3 e 5). In realtà, questi topi, che non esprimono Cochlin, non mostrano alcun apparenti anomalie dell'orecchio interno e l'eventuale perdita dell'udito significativa, anche se più tardi temporali punti devono ancora essere valutati. I nostri studi mostrano Cochlin-colorazione depositi eosinofili in DFNA9, oltre alla mancanza di patologia conclamata in Coch (- / -) topo a 5 mesi di età, sono un ulteriore sostegno che questo disturbo non è probabilmente dovuto al COCH haploinsufficiency, ma piuttosto un risultato di effetti deleteri di un meccanismo molecolare di mutazioni missense COCH'guadagno di funzione'.

Depositi Cochlin trovati nel glaucoma

Recenti studi di proteomica hanno rivelato Cochlin come il più frequentemente rilevati proteine ​​mediante spettrometria di massa nella rete trabecolare (TM) di occhi umani glaucomatosi, ma assente nelle normali occhi dei donatori di controllo di pari età (54).L'immunoistochimica ha rivelato depositi Cochlin-colorazione co-localizzazione con la sostanza mucopolisaccaride nella TM intorno al canale di Schlemm negli occhi glaucomatosi nell'umano e nel modello DBA / 2J il mouse per il glaucoma (54, 55). Analisi Western blot ha mostrato un aumento dei livelli Cochlin con l'aumentare dell'età in uomo e topo, con la progressione della malattia, così come una diminuzione parallela collagene di tipo II, una componente importante della normale TM. Si ipotizza che l'architettura alterato di questo tessuto può causare ostruzione del flusso acquosa nell'occhio (54, 55). Questi studi suggeriscono disregolazione di espressione Cochlin in un sottogruppo di glaucomi umano e topo. Il ritrovamento di Cochlin depositi in questi occhi è concomitante con un aumento della pressione intraoculare e precede danno del nervo ottico e la degenerazione delle cellule gangliari (54, 55).Somiglianze interessanti come Cochlin deposizione e danno neuronale esistere tra le conclusioni di glaucoma e in DFNA9; studi paralleli potranno fornire una visione in funzione Cochlin e il suo ruolo nei processi di malattia in questi due sistemi sensoriali.

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Fazzoletti

Tessuti di topo sono stati ottenuti in base alle linee guida e protocolli approvati dal Comitato di Harvard Scuola Medica permanente per animali (Boston, MA, USA). Ossa temporali umani sono stati ottenuti in conformità con le linee guida stabilite dai comitati ricerca umana al Massachusetts Eye e Ear Infirmary (Boston, MA, USA) e il Canisio Wilhelmina Hospital (Nijmegen, Paesi Bassi).

Topi postnatale (3-6 mesi di età) sono stati utilizzati in questo studio.Wild-type (+ / +) topi sono stati utilizzati per la valutazione di istologia normale, localizzazione Cochlin e analisi proteomica Coch. (- / -) Topo, utilizzato come controlli negativi, erano un regalo di Drs Colin Stewart e Clara Rodriguez (29). I topi sono stati perfusi intracardiaca e tessuti fissati in paraformaldeide al 4%. Dopo la rimozione della staffa dalla finestra ovale e foratura del finestra rotonda, 4% paraformaldeide fissativo è stato perfuso dolcemente attraverso la coclea. Orecchio interno sono stati immersi in fissativo per 2-4 h, seguito da decalcificazione in 120 m Macido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per 1 settimana a temperatura ambiente, e inclusi in paraffina da procedure istologiche standard. Sezioni seriali sono stati ottenuti a spessore 5-8 micron e utilizzati per la colorazione con ematossilina e eosina (H & E) e per immunoistochimica.Per l'analisi proteomica, tessuti cocleari e vestibolari stati sezionati separatamente e trattati come descritto in 'Analisi proteomica'.

Per tessuti umani, ossa temporali da una femmina di 67 anni, che era un membro di una grande DFNA9 affini nei Paesi Bassi segregare la Cochlin mutazione P51S (5, 11), sono stati donati e trattati presso il Laboratorio Otopathology del Massachusetts Eye and Ear Infermeria, Boston, MA.Tempo di post-mortem per i tessuti ottenendo era 6 ore. In questo individuo DFNA9, l'insorgenza della sordità neurosensoriale bilaterale e squilibrio si è verificato intorno all'età di 40 anni con una progressione di sordità profonda per età 63, che è stata documentata da valutazione audiologica. Sintomi vestibolari consisteva di squilibrio andatura, l'instabilità nel buio e oscillopsia. Esami vestibolari rivelato bilaterale ipofunzione vestibolare periferica. Per i controlli non colpiti (senza storia di perdita di udito), ossa temporali ottenuti da due donatori, una femmina di 63 anni e un maschio di 75 anni, sono stati utilizzati. Tempi post-mortem per l'ottenimento di tessuti di controllo erano 8 e 15 ore, rispettivamente. Ossa temporali sono stati fissati in formalina al 10%, di calce in EDTA e ridotte utilizzando lamette per contenere solo la capsula otica e dell'orecchio interno. Per ottenere la morfologia ottimale di sezioni, una delle ossa temporali DFNA9 (lato sinistro) è stato incorporato in celloidina, come è standard con ossa temporali trasformati per la luce studio microscopico. Immunostaining è impegnativo nelle sezioni celloidina-embedded, anche se non c'è l'integrità del tessuto molto meglio in questo mezzo (Fig. 2); Pertanto, per facilitare immunoistochimica, l'altro osso temporale (lato destro) è stato incorporato in paraffina. Questo è il primo e unico dell'osso temporale da un membro della famiglia DFNA9 che si è inclusi in paraffina ad oggi, facilitando così le nostre analisi. Per i controlli non colpiti, le ossa temporali dal 63-year-old donna sono stati incorporati in celloidina, e quelli dal 75-anno-vecchio maschio in paraffina. I campioni sono stati sezionati in serie con uno spessore di 20 micron per celloidina e 8 micron per paraffina, e sezioni selezionate colorate con H & E. Sezioni di paraffina sono stati trattati per immunoistochimica e analisi proteomica come descritto di seguito.

Immunoistochimica

L'immunocolorazione è stata eseguita usando un anticorpo anti-Cochlin generato contro un peptide nel dominio vWFA1 di Cochlin (Fig. 1),corrispondente ad amino acidi 163-181 di residui Cochlin umana, identici ai residui negli murino e Cochlin bovina (31). Anti-siero è stato purificato attraverso una colonna di proteina A sefarosio, seguita da cromatografia peptide-affinità. Questo anticorpo (anti-Cochlin / dominio vWFA1) riconosce tutte e tre le isoforme diverse dimensioni di Cochlin (Fig. 1).

Immunoistochimica è stata eseguita come descritto in precedenza (19), ad eccezione delle modifiche come descritto di seguito, tra cui la mancanza di fase antigene recupero. Sezioni in paraffina da postnatale (+ / +) eCoch (- / -) topo, il controllo inalterata e DFNA9 colpite umano adulto ossa temporali sono stati incubati con anticorpi anti-Cochlin / anticorpo dominio vWFA1 notte a temperatura ambiente, lavate e incubate con un IgG biotinilato secondario anti-coniglio (Vector Labs, Burlingame, CA, USA). L'immunocolorazione è stata visualizzata mediante incubazione con il reagente Vectastain ABC (Vector Labs) seguita da 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Le sezioni non sono state contrastate.

Analisi proteomica

Per l'analisi proteomica nel topo, cocleare membranosa e labirinti vestibolari stati sezionati separatamente da circa 3 mesi (+ / +) e Coch (- / -) topo. Lisati proteici sono stati preparati mediante incubazione dei tessuti in un tampone di lisi [2% sodio dodecil solfato (SDS), 100 m di bicarbonato M ammonio, 10 m M ditiotreitolo (DTT), pH 8,5] a 90 ° C per 10 min, 37 ° C per 60 min, con successiva sonicazione in 0,2% SDS, e l'incubazione a 90 ° C per 10 min. Tre cicli di sonicazione e bollente sono stati eseguiti, seguita da alchilazione con 30 m M iodoacetamide. La reazione è stata spenta con 10 m M DTT e campioni sono stati separati mediante elettroforesi su gel SDS in 8-16% gel di poliacrilammide. Gel erano di dimensioni frazionata in quattro sezioni, decolorato con due lavaggi di metanolo al 50% e 5% di acido acetico, seguito da tre lavaggi alternati di bicarbonato di ammonio e acetonitrile.Fette di gel sono stati essiccati e successivamente sospeso singolarmente in tripsina (5,5 mg / ml a 50 m M bicarbonato di ammonio) prima dell'incubazione a 37 ° C per 18 ore per la digestione delle proteine. I peptidi sono stati estratti con due risciacqui di 50 m M bicarbonato di ammonio e due risciacqui di 50% acetonitrile e 0,1% di acido formico. I campioni sono stati preparati per spettrometria di massa mediante liofilizzazione e reidratazione in 5% acetonitrile e 0,1% di acido formico.

Per l'analisi proteomica dell'orecchio interno umano adulto, gli unici materiali disponibili erano, tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina.Sezioni di 8 micron di spessore sono stati utilizzati dallo stesso osso temporale DFNA9 colpite usati per immunoistochimica. Per un controllo dell'osso temporale umano adulto, fissati in formalina, inclusi in paraffina, 8 micron sezioni spesse sono stati utilizzati da un 85-anno-vecchia femmina con otosclerosi, ma senza mostrare istopatologia orecchio interno e con le strutture dotto cocleare normali tra cui il legamento a spirale e limbus spirale.

Estrazione di proteine ​​da sezioni incluse in paraffina umani è stata effettuata aggiungendo eptano e incubando a temperatura ambiente per 60 min, seguito dall'aggiunta di metanolo alle proteine ​​pellet estratti. Gli estratti proteici sono stati resolubilized e sonicate nel 2% SDS, 100 m Mbicarbonato di ammonio, 10 m M DTT, pH 8,5. Riduzione delle proteine ​​è stato raggiunto da campioni di ebollizione a 90 ° C per 20 minuti, seguita da incubazione a 37 ° C per 60 min e alchilazione in 30 m Miodoacetamide per 60 min a temperatura ambiente. Tripsina digestione delle proteine ​​e la preparazione per spettrometria di massa sono state eseguite come descritto per i campioni del mouse.

Per la spettrometria di massa, i campioni sono stati eseguiti su una workstation LCQ DECA XP più Proteome X (Thermo Electron Corporation, San Jose, CA, USA). Identificazioni Peptide sono state effettuate utilizzando Sequest attraverso il browser Bioworks 3.1 (Thermo Electron Corporation).Ricerche nelle banche dati sono state effettuate utilizzando i database NCBI RefSeqHuman e RefSeqMurine utilizzando cisteine ​​statici carbamidomethyl modificati e differenziali ossidato metionine, seguiti da ulteriori ricerche utilizzando modifiche differenziali.

Reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa

RT-PCR è stata eseguita con RNA totale isolato da linee cellulari EBV-trasformati da due individui P51S DFNA9, utilizzando il RNAeasy midi-kit (Qiagen, Leusden, Paesi Bassi). sintesi del cDNA è stata eseguita come descritto (56) e la PCR è stata eseguita per 35 cicli in condizioni standard utilizzando i seguenti primers fiancheggianti la mutazione: forward 5'-ACCAGAGGCTTGGACATCAG-3 'nell'esone 4 e reverse 5'-TTTGAGACTGGATGCCATTG-3' nell'esone 5 . I prodotti amplificati erano gel isolato e sequenziato utilizzando un kit di reazione ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing V2 Ready e l'apparato ABI 3730 sequenziamento del DNA (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

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Il materiale supplementare è disponibile presso HMG Online. La figura complementare mostra immunoistochimica eseguita su umano adulto sezioni dell'osso temporale con il solo anticorpo secondario, come controllo negativo; viene rilevata alcuna colorazione.

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Siamo particolarmente grati agli individui e alle loro famiglie per la donazione di ossa temporali e una descrizione più dettagliata della istopatologia P51S DFNA9 è in preparazione per la pubblicazione.Vorremmo ringraziare il Dott Roderick Bronson e Li Zhang al Dana Farber / Harvard Cancer Center Roditore Histopathology Core. Ringraziamo anche Drs Colin Stewart e Clara Rodriguez per il loro dono della Coch (- / -) topo. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH / NIDCD concede R01-DC03402 (a CCM), R01-DC0188 e P30-05209 (a MCL), il NIDCD Nazionale Osso temporale, udito e l'equilibrio Patologia Registro delle risorse e dal signor Axel Eliasen, e la salute e Labor Sciences Research Grants in Giappone (Ricerca sulle misure per le malattie intrattabili, e disturbi sensoriali e comunicativi) (TI).

Questo manoscritto è dedicato da Cynthia Morton alla memoria di Craig Philip Morton, scomparso il 9 luglio 2005 di cancro al pancreas, e che alla sua morte donò le sue ossa temporali al NIDCD Nazionale Osso temporale, udito e l'equilibrio Patologia Registro Resource ( http://www.tbregistry.org/) dopo aver lottato con la malattia di Meniere durante la sua vita troppo breve.

Conflitto di interessi dichiarazione. Nessuno ha dichiarato.

• © L'Autore 2006. Pubblicato dalla Oxford University Press. Tutti i diritti riservati. Per Autorizzazioni, inviare un'e-mail: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.

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• Abstract
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• Abstract
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Phenotype Analysis of an Australian DFNA9 Family with the I109N COCH MutationAnn Otol Rhinol Laryngol (2011) 120 (6): 414-421

• Abstract
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• Abstract
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COCH Transgene Expression in Cultured Human Trabecular Meshwork Cells and Its Effect on Outflow Facility in Monkey Organ Cultured Anterior SegmentsIOVS (2010) 51 (4): 2060-2066

• Abstract
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Proteome bioprofiles distinguish between M1 priming and activation states in human macrophagesJ. Leukoc. Biol. (2010) 87 (4): 655-662

• Abstract
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Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGF{beta}2 TreatmentIOVS (2009) 50 (2): 551-559

• Abstract
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A targeted Coch missense mutation: a knock-in mouse model for DFNA9 late-onset hearing loss and vestibular dysfunctionHum Mol Genet (2008) 17 (21): 3426-3434

• Abstract
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Phenotype Description of a Novel DFNA9/COCH Mutation, I109TAnn Otol Rhinol Laryngol (2007) 116 (5): 349-357

• Abstract
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