Gene dell’otoferlina ,OTOF, (DFNB9)
- Categoria: Sordita Non-Sindromiche
- Pubblicato: Mercoledì, 15 Gennaio 2014 16:58
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8.2.3. Una mutazione del Gene dell’otoferlina OTOF (DFNB9) provoca DFNB9, una forma non sindromica di sordità,
%26safe%3Dactive%26rlz%3D1C2KMZB_enIT515IT523%26biw%3D1056%26bih%3D920&rurl=translate.google.it&sl=pt-BR&u=http://pt.wikipedia.org/wiki/Ficheiro:PBB_GE_OTOF_220492_s_at_tn.png&usg=ALkJrhhpe6T4UoBM9nGNHWqf_u8Ehxfi1A)
Le mutazioni del gene
dell’otoferlina sono responsabili della forma recessiva DFNB9. L’otoferlina è
una proteina che interviene nella regolazione delle vescicole presinaptiche
delle cellule cigliate interne La sordità è prelinguale di grado severo- profondo
.La particolarità di questa forma di sordità è che essa può presentarsi come
una neuropatia auditiva, con otoemissioni acustiche OAE inizialmente conservate
ABR assente. Starr [67] ha per primo utilizzato il termine di neuropatia
uditiva per designare nell'adulto delle sordità, spesso bilaterali, associate a
un'alterazione dei potenziali evocati uditivi (PEU) contrastante con la
presenza di otoemissioni acustiche (OEA) normali. Queste forme sono oggi meglio
conosciute nell'adulto e nel bambino e giustificano la valutazione delle
otoemissioni per individualizzarle nel corso della gestione di una sordità di
percezione. La frequenza di disordini uditivi attribuiti a neuropatia è
relativamente elevata fra i casi di neonati in terapia intensiva (1%). Fra
questi neonati la prevalenza di otoferlina anomala è probabilmente minoritaria.
L’importanza di una diagnosi molecolare nei casi di “neuropatia uditiva”
risiede nel fatto che i casi con anomalo otoferlina sono dei candidati
all’impianto cocleare con prospettive di un ricupero funzionale comparabile a
qualsiasi altra cocleopatia. Mutazioni in questo gene sono la causa di non
sindromica sordità neurosensoriale DFNB9 recessiva. La forma breve della
proteina codificata ha 3 C2 domini, un unico transmembrana dominio
carbossi-terminale trovato anche in fattore spermatogenesi di C.elegans, RES-1,
e anche in disferlina umana, mentre la forma lunga ha sei domini C2..
L’OTOFERLINA SINAPTICA ALTERATA E’ CAUSA DI SORDITA’
Ruolo dell’otoferlina nella fisiologia sinaptica, è un’ulteriore prova dei rapporti fra questi studi di base e la patologia.
Un gruppo di ricerca guidato da Roux, nel laboratorio di Christine Petit, identificando il ruolo dell’otoferlina nelle sinapsi delle cellule ciliate della coclea (IHC), ha definito il processo alla base della grave forma di sordità causata da alterazioni nel gene di questa proteina (Roux I., et al., Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell 127, 277-289, 2006).
Per convertire la complessa struttura del suono in impulsi nervosi, le IHC devono trasmettere segnali al nervo acustico secondo una codifica di alta precisione; in tali processi sembrano avere un ruolo importante le loro speciali giunzioni note come ribbon synapses, la cui configurazione molecolare è oggetto di intensi studi, ma la cui fisiologia è ancora scarsamente nota. Impiegando l’immunofluorescenza, Roux e i suoi colleghi hanno localizzato l’otoferlina nelle IHC e, successivamente, con l’ausilio della immunogold electron microscopy, hanno condotto uno studio ultrastrutturale molto dettagliato, che ha consentito loro di precisarne la sede in corrispondenza delle vescicole sinaptiche.
I topi privi di otoferlina sono sordi e, in seguito a stimolazione acustica, non presentano le normali risposte dei neuroni del tronco encefalico (potenziali evocati), sebbene abbiano una struttura sinaptica normale. Dunque, i ricercatori hanno ipotizzato che il ruolo della proteina fosse da ricercarsi in processi legati alla dinamica delle vescicole sinaptiche.
Le prime indagini hanno mostrato che il numero di vescicole sinaptiche presenti nei terminali delle IHC dei topi con deficit di otoferlina, era simile a quello dei topi di controllo e che la localizzazione presso i siti della membrana presinaptica risultava del tutto normale.
Quando i ricercatori hanno valutato la presenza della normale esocitosi conseguente all’ingresso di calcio nelle IHC dei topi con deficit di otoferlina, hanno rilevato una grossa anomalia, ossia la quasi completa assenza di questa risposta.
Il ruolo dell’otoferlina, dunque, sembra consistere nel controllo dell’ultimo stadio del processo di esocitosi delle vescicole contenenti il neurotrasmettitore. Roux e collaboratori hanno allora cercato di definire con maggiore precisione il meccanismo dell’azione della molecola da loro studiata. Poiché la sequenza aminoacidica del polipeptide corrisponde a quella di una proteina di membrana legante il calcio, hanno valutato questa possibilità, trovandone poi conferma: l’otoferlina lega il Ca2+ necessario per l’esocitosi.
Gli esperimenti di legame in vitro e l’immunoprecipitazione hanno rivelato che l’otoferlina interagisce con i componenti dell’apparato di secrezione sinaptica mediante una modalità calcio-dipendente.
E’ stato riportato che l’esocitosi indotta da depolarizzazione è linearmente dipendente dall’entità del flusso in entrata del Ca2+ presinaptico, cosa che, nel caso delle cellule IHC, vuol dire diretto rapporto fra intensità del suono ed esocitosi.
Christine Petit e colleghi propongono che la capacità dell’otoferlina di legare il Ca2+, e la dipendenza dal legame col calcio per l’interazione con l’apparato secretorio, consentono a questa proteina di agire da trigger del Ca2+, inducendo una rapida e precisa esocitosi in risposta alle vibrazioni sonore che depolarizzano le IHC. Infine, suggeriscono che l’otoferlina sostituisca le sinaptotagmine I e II che non sono state trovate nelle ribbon synapses delle cellule IHC.
Figu 1. illustrazioni schematiche di una cellula ciliata interna (IHC, a forma di pallone) e una cellula ciliata esterna (OHC, cilindrico) che mostra posizioni nella membrana basolaterale prodotti genici funzionalmente importanti. Le cellule ciliate interne sono veri recettori sensoriali che segnalano la ricezione del suono al cervello attraverso sinapsi afferenti al nervo uditivo. E 'quindi forse non è sorprendente trovare difetti dell'udito associati con le molecole che possono influenzare la funzione di rilascio del trasmettitore sinaptico di queste cellule: dei canali del calcio di tipo L voltage-gated per consentire flusso di calcio, la pompa del calcio Atp2b2 e l’otoferlin. Le cellule ciliate esterne hanno una funzione motoria localizzata all'interno della coclea con cui si pensa che Prestin e possibilmente Glut5 siano associati. Il canale del potassio KCNQ 4 è probabilmente coinvolto nel riciclaggio del potassio. Il pattern di espressione diversa di questi geni nelle cellule ciliate interne rispetto alle cellule ciliate esterne enfatizza le diverse funzioni nelle risposte cocleari.
Quale sono i cambiamenti nel gene OTOF ?
Sordità sindromica - causata da mutazioni nel gene OTOF
sono stati identificati Almeno 16 mutazioni nel gene OTOF nei pazienti con una forma di sordità non sindromica (perdita di udito senza segni e sintomi correlati che interessano altre parti del corpo) ha chiamato DFNB9. Le persone con queste mutazioni hanno un tipo di perdita uditiva chiamata neuropatia, che si verifica quando il suono non viene trasmesso correttamente dall'orecchio interno al cervello dell'udito.
Alcune mutazioni nel gene OTOF determinano una produzione di otoferlin anormalmente ridotta, versione non funzionali di otoferlin o impediscono alle cellule la produzione di una qualsiasi di questa proteine. Altre mutazioni genetiche probabilmente alterano la struttura 3-dimensionale dell’ otoferlin, che compromette la sua capacità di legarsi al calcio.
Una particolare mutazione OTOF è una causa comune della sordità non sindromica nella popolazione spagnola. Questa mutazione sostituisce un blocco di costruzione amminoacido, la glutammina, con un segnale che interrompe la produzione di proteine prematuramente alla posizione 829 nella proteina otoferlin (scritto come Gln829Ter o Q829X). La mutazione Q829X provoca una versione anormalmente corto di otoferlin , che interrompe la funzione della proteina e porta alla perdita dell'udito.
Dove si trova il gene OTOF?
Citogenetica Località: 2p23.1
Posizione molecolare sul cromosoma 2: coppie di basi 26.457.203 a 26,558,698
(Homo sapiens
Annotazione di uscita 107, GRCh38.p2) (NCBI 
)
Il gene OTOF si trova sul breve (p) braccio del cromosoma 2 alla posizione 23.1.
Più precisamente, il gene OTOF si trova dalla coppia di basi 26.457.203 di paia di basi 26.558.698 sul cromosoma 2.
The Journal of Neuroscience, 26 Agosto 2009 • 29 (34): 10474 -10 487 Otoferlin è fondamentale per un esocitosi cellulare calcio-dipendente altamente sensibile e lineare a vestibolare capelli del nastro Sinapsi Didier Dulon, Saaid Safieddine, Sherri Jones, e Christine Petit Université Victor Segalen Bordeaux 2, Bordeaux Neuroscience Institute, Squadra uditiva Neurofisiologia di Synapse, Inserm Misto Unità di Ricerca 587 Salute, University Hospital Hôpital Pellegrin, 33076 Bordeaux, Francia. Didier Dulon riassume otoferlin .. . La otoferlin è una grande proteina di 2000 aminoacidi appartenenti alla famiglia di ferlines (vedi schema A). E 'molto vicino a disferlina: una proteina essenziale nel traffico vescicolare e la membrana riparazione delle cellule muscolari. Si compone di 6 aree C2 componenti potenziali siti per l'associazione di calcio e l'interazione con fosfolipidi di membrana. Questa proteina ha un singolo segmento transmembrana al C-terminale che costituisce una possibile ottico sulla membrana plasmatica e / o vescicole neurotrasmettitore. Otoferlin è riconosciuta come una proteina essenziale per esocitosi * vescicole neurotrasmettitore cellule ciliate cocleari (udito sytem). . Il ruolo preciso della proteina sinaptica rimane poco compresa L'ipotesi corrente è che agirebbe come un sensore di calcio coordinare la fusione delle vescicole sinaptiche con flusso di calcio dall'attivazione dei canali del calcio (tipo L: CAV1 0,3). Il possibile ruolo di otoferlin nella trasmissione sinaptica di altre cellule ciliate sensoriali nell'orecchio interno, quelli della sala non era ancora stata esplorata fino ad oggi. Il nostro studio pubblicato sul Journal of Number Neuroscience mostra che otoferlin si esprime nella regione sinaptica di diversi rilevatori angolari e accelerazione lineare sono cellule ciliate degli organi vestibolari. fiale, utricolo e saccule Il vestibolare potenziali evocati sono significativamente influenzati nei topi con il gene OTOF è inattivato (Otof- /), suggerendo che otoferlin è importante per le cellule normali capelli neurotrasmissione del vestibolo. Mostriamo infatti che la rapida esocitosi delle cellule ciliate sinaptici di tipo I e tipo II è in gran parte ridotta in tès la Otof - / - mice. Lo studio sulle cellule vestibolari, dove esocitosi non è completamente abolito come le cellule dei capelli, ci permette di specificare che otoferlin certamente agisce come un sensore di calcio con alta affinità. Il otoferlin permette linearizzazione di esocitosi con il calcio di entrare nella stimolazione basso. I nostri risultati suggeriscono anche che uno o più altri sensori di calcio di minore affinità (synaptotagmines?) Sono utilizzati anche a livello delle cellule sensoriali della porta, in particolare nelle cellule di tipo II.
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17. Moreli RI. Kim HJ, Hood LJ, Goforth L. Friderici K, Fisher R. et al Mutations in the connexin 26 gene (GJB2) among Ashkenazi Jews wìth nonsyndromic recessive deafness N EngI J Med 339:1500-5. 1998
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Gene dell'otoferlina, OTOF EMC
Le mutazioni del gene dell'otoferlina, OTOF, sono responsabili della forma di sordità recessiva DFNB9. [64] L'otoferlina sarebbe implicata nel traffico vescicolare presinaptico delle cellule ciliate interne. [65] La sordità è grave o profonda, prelinguale, e una mutazione di questo gene, Q829X, sembra particolarmente frequente in Spagna. [66]
La particolarità di questa forma di sordità è che essa può presentarsi come una neuropatia auditiva, con otoemissioni acustiche inizialmente conservate. Starr [67] ha per primo utilizzato il termine di neuropatia uditiva per designare nell'adulto delle sordità, spesso bilaterali, associate da assenza dell’ABR ,contrastante con la presenza di otoemissioni acustiche (OEA) normali e grave deficit delle abilità percettive verbali . Queste forme sono oggi meglio conosciute nell'adulto e nel bambino e giustificano la valutazione delle otoemissioni per individualizzarle nel corso della gestione di una sordità di percezione.
La frequenza di queste sordità è molto elevata (1%) nei neonati ricoverati in terapia intensiva, il che giustifica uno screening delle sordità con i potenziali evocati piuttosto che con OEA in questa popolazione. Le mutazioni dell'otoferlina sono probabilmente rare tra i bambini con una diagnosi di «neuropatia auditiva»: Madden, [68] tra 22 casi pediatrici, descriveva 15 casi (68%) con patologie neonatali intricate (iperbilirubinemia: 11/15, prematurità: 10/15, farmaci ototossici: 9/15, ventilazione assistita: 8/15) e e sei casi erano rappresentati da coppie di due fratelli sordi che evocavano una causa genetica autosomica recessiva, non essendo stato ricercato il gene della DFNB9, OTOF .
Il termine neuropatia uditiva sembra assolutamente inappropriato per la sordità dovuta al gene OTOF, sordità di origine cocleare per la quale i risultati di impianto cocleare sembrano del tutto paragonabili ai risultati abituali dell'impianto. [69]
Lo studio morfologico dell’orecchio interno e del nervo uditivo con RM nei pazienti che presentano un quadro clinico di neuropatia ha evidenziato nel 18% dei casi la presenza di un’anomalia anche anatomica del nervo acustico che appare ipoplasico, inono- o bilateralmente2’. E’ fondamentale chiarire la presenza di una riduzione del calibro del nervo o addirittura la sua assenza prima di procedere a intervento di impianto cocleare che nel primo caso ha opportunità di successo mentre nel secondo caso è controindicato,
[65]
Petit C., Levilliers J., Marlin S., Hardelin J.P. Hereditary hearing loss Metabolic and molecular basis of inherited disease New York: McGraw-Hill Publishers (2001). 6281-6328
[66]
Migliosi V., Modamio-Hoybjor S., Moreno-Pelayo M.A., Rodrigues-Ballesteros M., Villamar M., Telleria D., e al. Q829X, a novel mutation in the gene encoding otoferlin (OTOF), is frequently found in Spanish patients with prelingual non-syndromic hearing loss J. Med. Genet. 2002 ; 39 : 502-506 [cross-ref]
[67]
Starr A., Picton T.W., Sihinger Y., Hood L.J., Berlin C.I. Auditory neuropathy Brain 1996 ; 119 : 741-753 [cross-ref]
[68]
Madden C., Rutter M., Hilbert L., Greinwald J.H., Choo D.I. Clinical and audiological features in auditory neuropathy Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 2002 ; 128 : 1026-1030
[69]
Loundon N., Marcolla A., Marlin S., Denoyelle F., Roux I., Feldmann D., e al. Auditory neuropathy or endocochlear hearing loss? Otol Neurotol 2005 ; (in press).
APPROFONDIMENTO
- Articolo
- 2010 // JCB vol. 191 n. 1 187-197
Otoferlin è un sensore di calcio che regola direttamente SNARE mediata fusione della membrana
1. Colin P. Johnson 1, 2 e
2. Edwin R. Chapman 1, 2
+ Corrispondenza di Edwin R. Chapman: chapman @ physiology.wisc.edu
Astratto
Otoferlin è una grande proteina dominio multi-C2 proposto di agire come un sensore di calcio che regola sinaptica vescicole esocitosi in cellule ciliate cocleari. Anche se mutazioni in otoferlin sono stati associati con la sordità, il suo contributo alla liberazione di neurotrasmettitori è irrisolto. Utilizzando proteine ricombinanti, dimostriamo che cinque dei sei C2 domini otoferlin calcio senso con costanti di dissociazione apparente che andavano 13-25 micron; in presenza di membrane, queste affinità apparenti aumentano fino a sette volte. Utilizzando un saggio fusione delle membrane ricostituito, abbiamo scoperto che cinque dei sei C2 dominii otoferlin stimolare fusione delle membrane in modo calcio-dipendente. Dimostriamo anche che il legame con deficit di un calcio sotto forma di dominio C2C è in grado di stimolare la fusione delle membrane, sottolineando ulteriormente l'importanza del calcio per la funzione della proteina. Questi risultati dimostrano per la prima volta che otoferlin è un sensore di calcio in grado di regolare direttamente reazioni solubili N-etil maleimmide sensibili proteina di fusione della proteina attaccamento recettoriali di membrana fusione.
Introduzione
La coclea è un tubo a spirale piene di liquido trovato all'interno dell'orecchio interno, dove svolge un ruolo centrale nella audizione dei mammiferi. In risposta al suono, fasci capelli situati su cellule ciliate all'interno della coclea sono deviati, causando l'apertura dei canali ionici meccanosensibili che alterano la tensione della membrana cellulare. Questo cambiamento di potenziale di membrana determina l'attivazione dei canali del calcio di tipo L voltage-gated per consentire flusso di calcio, che innesca sinaptiche esocitosi delle vescicole e rilascio dei neurotrasmettitori (Glowatzki e Fuchs, 2002). Questa catena di eventi deve avvenire rapidamente distinguere temporalmente tra suoni (Rose et al., 1967).Sinapsi formate dalle cellule ciliate interne (IHCS) contengono anche le strutture specializzate chiamate nastri sinaptiche che sono in grado di legare numerose vescicole sinaptiche in siti di rilascio per facilitare alti tassi di trasmissione sinaptica sostenuta(Liberman, 1980; Glowatzki e Fuchs, 2002).
Il passo fusione delle vescicole si crede di essere mediato dalle proteine SNARE synapbtobrevin 2, sintaxina 1A, e SNAP-25 sulle vescicole e membrane plasmatiche(Safieddine e Wenthold, 1999). Tuttavia, SNAREs non sono sensibili al calcio, e in saggi di fusione ricostituiti, mediano fusione su scale temporali che sono ordini di grandezza più lento rispetto osservata in vivo (Weber et al., 1998). Nei neuroni, la sensibilità di calcio e cinetiche veloci sono in genere conferiti da proteine SNARE vincolanti, tra cui synaptotagmin I / II (Chapman, 2008). Tuttavia, le cellule dei capelli mature hanno poco o nessun synaptotagmin I / II (Safieddine e Wenthold 1999), ed è stato proposto che la proteina transmembrana otoferlin potrebbe servire come il sensore di calcio che regola il rilascio di neurotrasmettitori cella capelli accelerando SNARE-mediata fusione della membrana (Roux et al., 2006).
Otoferlin verifica in molteplici varianti di splicing, compresa una forma acida 1.997-amino, consiste di un segmento transmembrana e citoplasmatici sei domini C2, e un breve tre C2 isoforma dominio trovato negli esseri umani, ma non topi (Yasunaga et al., 2000). Un ruolo per otoferlin nel rilascio di neurotrasmettitore IHC si basa su diverse linee di prove, tra cui la constatazione che i topi privi otoferlin sono profondamente sordi, ma hanno processi di trasduzione mechanoelectrical intatti e funzionali (Roux et al., 2006). Questi topi hanno anche neuroni afferenti funzionali, suggerendo che il ruolo di otoferlin nel percorso uditivo si trova all'interno della cellula pelo tra le trasduzione e afferenti attivazione dei neuroni passi mechanoelectrical. A sostegno di questa idea, le cellule ciliate nei topi knockout otoferlin non rilasciano neurotrasmettitori in risposta alla depolarizzazione della membrana e afflusso di calcio, pur avendo apparentemente normale morfologia delle sinapsi (Roux et al., 2006). Inoltre,> 16 differenti mutazioni nonsense e missense nel gene codificante umano otoferlin sono stati collegati a un tipo di perdita di udito non sindromica conosciuta come DFNB9. Tuttavia, gli studi di localizzazione subcellulare hanno portato a conclusioni contrastanti. Uno studio immunogold colorazione riferisce localizzazione di vescicole sinaptiche (Roux et al., 2006,mentre immunofluorescenza indicato che otoferlin è localizzato prevalentemente Golgi ed eventualmente in endosomi precoci) (Schug et al., 2006; Heidrych et al., 2008). Così, otoferlin può avere funzioni alternative o aggiuntive, come il riciclo delle vescicole o il traffico di membrana nelle Golgi. Recentemente, è stato riferito che mutazioni puntiformi all'interno otoferlin provocato membrana plasmatica ripiegamento (Heidrych et al., 2008).Ciò suggerisce un ruolo per otoferlin nella endocitosi e vescicole riciclaggio e potrebbe spiegare il motivo otoferlin IHC difetti ko esporre in esocitosi.
Da studi basati sulle cellule, non è del tutto chiaro se otoferlin contribuisce direttamente alla esocitosi o è coinvolta in eventi secondari e / oa valle di vescicole sinaptiche fusione.Tuttavia, va notato che questi processi cellulari pongono diverse esigenze funzionali sulla proteina, e si può quindi ottenere informazioni sul ruolo di otoferlin in cellule ciliate attraverso studi funzionali in vitro. In particolare, se otoferlin è infatti un sensore di calcio coinvolte nel rilascio di neurotrasmettitore, ci aspetteremmo forme ricombinanti della proteina di legare calcio, SNAREs, e membrane e di accelerare SNARE mediata fusione delle membrane in modo calcio-dipendente. In questo studio, abbiamo proiettato l'individuo otoferlin domini C2 per queste proprietà per determinare se otoferlin opera come un sensore di calcio. Inoltre, una grande tre C2 costrutto dominio, C2DEF, è stato creato per verificare le proprietà del segnalato piccolo tre C2 variante di splicing del dominio. Un costrutto C2ABC è stato analizzato in parallelo per determinare quali sono i domini aggiuntivi tre C2 N-terminali, che si trova nella isoforma più grande, contribuiscono alla funzione della molecola.
Risultati
Otoferlin è un sensore di calcio
È stato suggerito che otoferlin potrebbe funzionare come un sensore di calcio in cellule ciliate interne cocleari, le cellule ciliate esterne, e le cellule vestibolari, analogo al ruolo che synaptotagmin I / gioco II durante il rilascio dei neurotrasmettitori SNARE-mediata nei neuroni (Roux et al., 2006) . Entrambi i domini C2 di synaptotagmin mi legano ioni calcio attraverso il coordinamento con residui di aspartato situati su una estremità di ogni dominio C2 (Shao et al., 1998;. Fernandez et al, 2001). L'allineamento della sequenza primaria dei domini C2 otoferlin con residui aspartato leganti il calcio di synaptotagmin I rivela una mancanza di conservazione tra i primi tre domini C2 N-terminale della proteina(Fig. 1, A e B). Tuttavia, i domini C2 da diverse altre proteine non possiedono tutti cinque residui aspartato ancora, in alcuni casi, sono ancora in grado di legare il calcio (Therrien et al., 2009). Pertanto, non è chiaro dal controllo della sequenza da cui dominii otoferlin eventuali legare il calcio. Per rispondere a questa domanda, abbiamo esaminato la fluorescenza intrinseca dei costrutti otoferlin ricombinanti in funzione della concentrazione di calcio. In molti casi, gli spettri di fluorescenza di amminoacidi aromatici all'interno di domini C2 hanno dimostrato di essere sensibile al legame del calcio (Nalefski et al., 2001).
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Figura 1.
Schema di full-length otoferlin ei frammenti otoferlin utilizzati in questo studio. (A) Otoferlin è composta da sei domini tandem C2 seguite da un dominio transmembrana C-terminale (TMD). Proteine ricombinanti composti da entrambi i domini C2 isolati o tre frammenti C2 dominio sono stati generati in base alle designazioni aminoacidi elencati a destra. (B) Conservazione di leganti leganti il calcio putativi dei domini C2 di otoferlin (oto).Synaptotagmin I (SYT) C2A e C2B sono elencati per il confronto. I numeri corrispondono all'ordine dei cinque residui di aspartato che funzionano come ligandi nella C2A (D172, 178, 230, 232, e 238) e domini C2B (D303, 309, 363, 365, 371) di synaptotagmin I (Sutton et al., 1995;. Shao et al, 1998; Fernandez et al., 2001).
Come una schermata iniziale per legare il calcio, gli spettri di fluorescenza di costrutti ricombinanti otoferlin sono stati misurati in presenza sia di 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio. Come mostrato in Fig. 2, aggiunta di calcio portato a significativi aumenti l'intensità di fluorescenza di isolato C2B, C2C, C2D, C2E, e C2F, ma non C2A. Inoltre, i frammenti ricombinanti C2ABC e C2DEF esposti anche aumenti significativi della fluorescenza in risposta al calcio. Per diversi frammenti otoferlin, abbiamo anche rilevato uno spostamento della lunghezza d'onda di emissione massimi (λ max). Questi cambiamenti sono stati più di primo piano nelle grandi tre frammenti C2 dominio, con il frammento N-terminale C2ABC visualizzazione di un cambiamento notevole blu e la C2DEF un leggero spostamento verso il rosso. Titolazioni calcio successivi portarono curve dose-risposta per sigmoidali entrambi i costrutti più grandi ei domini C2 isolate (Fig. 3, A e B). Da queste trame, [Ca 2+] 1/2 valori sono stati determinati (Tabella I). Per verificare la specificità del legame di calcio, gli esperimenti di titolazione sono stati ripetuti in presenza di magnesio 0,75 mM. Magnesio non ha avuto effetto sui calcio di dose-risposta, indicando che il legame è specifico per il calcio (dati non pubblicati).
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Tabella I.
[Ca 2+] 1/2 valori per ciascun dominio C2 di otoferlin
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Figura 2.
Normalizzato spettri di emissione di fluorescenza di nativi catene laterali aromatiche otoferlin in presenza di 0,1 mM EGTA o calcio 1 mM. 1 pM purificate otoferlin frammenti erano eccitati a 280 nm e gli spettri di emissione raccolti da 290 al 380 nm. Sono mostrati spettri rappresentante per ogni dominio in condizioni EGTA o di calcio.Le tracce sono dati rappresentativi dei quattro studi clinici indipendenti. FI, intensità di fluorescenza.
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Figura 3.
Cambiamenti calcio-dipendenti in fluorescenza otoferlin. (A e B) Trame normalizzati delle intensità di emissione di 1 micron dei tre-C2 frammenti dominio C2ABC e C2DEF (A) e 1 micron di isolato domini C2 C2B, C2C, C2D, C2E e C2F (B) in funzione di aumentare concentrazione di calcio in assenza di liposomi. (C e D) titolazioni calcio di C2ABC, C2DEF (C), e ciascun dominio C2 isolato di otoferlin (D) in presenza di liposomi composti da 15% PS, 55% PC e 30% PE. Le barre di errore indicano media ± DS (n = 4).
Molti domini C2 legano alle membrane, con diverse affinità e lipidi headgroup specificità, come parte integrante della loro funzione (Nalefski et al., 2001). Binding è spesso dipendente dal calcio, con il catione, proteine, lipidi e formando un complesso con un'affinità proteina calcio-binding migliorata. Per sondare i potenziali cambiamenti di affinità calcio indotti da membrane, curve di titolazione di calcio sono stati generati in presenza di liposomi composti da 15%, 30% DOPS PAPA, e il 55% POPC.Analogamente ai campioni senza liposomi, tutti i costrutti otoferlin tranne C2A visualizzato aumenti fluorescenza in presenza di calcio rispetto alle misurazioni effettuate in EGTA. I risultanti curve di titolazione di calcio (Fig. 3, C e D) per i campioni otoferlin-liposomi mostrano uno spostamento verso sinistra in [Ca 2 +] 1/2, con valori ≤10 micron per tutti i costrutti testati (Tabella I). Concludiamo che otoferlin lega calcio via almeno cinque dei suoi sei domini e che le membrane aumentare il legante il calcio affinità apparente di questi domini.
I domini C2 delle proteine SNARE legano otoferlin
Come descritto nell'introduzione, è stato riportato che associa otoferlin con le proteine t-SNARE sintaxina 1 e SNAP-25. Tuttavia, sono stati esaminati né i domini specifici di otoferlin che legano t-SNARE né gli effetti del calcio sulla rilegatura. Per affrontare questi problemi, un test di immunoprecipitazione è stata effettuata utilizzando il ricombinante t-SNARE eterodimero syntaxin1A / SNAP-25B e un anticorpo anti-sintaxina (Fig. 4, A e B).20 mM di ciascun otoferlin dominio C2 è stato testato per coimmunoprecipitation in presenza di 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio. Anche se tutti i sei domini immunoprecipitati con l'eterodimero t-SNARE, quattro dei domini isolati, C2C, C2D, C2E, e C2F, visualizzati attività di legame calcio-promossa (Fig. 4, A e B). Il legame di altri due domini, C2A e C2B, non è stata arricchita da calcio. Questi risultati sono coerenti con uno studio a discesa GST precedente, che ha concluso che C2A legato in maniera calcio-indipendente sintaxina, mentre l'attività-SNARE vincolante C2F era regolata dal calcio (Ramakrishnan et al., 2009).
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Figura 4.
Coimmunoprecipitation di eterodimeri t-SNARE con i domini C2 isolati di otoferlin.(A) I saggi sono stati eseguiti utilizzando 20 mM di ciascun dominio C2 usando un anticorpo monoclonale anti-sintaxina. T indica il dominio C2 totale caricato nel campione, e Ca ed E indicano la presenza di 1 mM di calcio o 0,1 mM EGTA, rispettivamente. H-chain denota la catena pesante dell'anticorpo anti-sintaxina (HPC-1). (B) La quantificazione dei dati coimmunoprecipitation tramite densitometria. (C) gel Rappresentante in cui ciascun dominio C2 isolato è stato analizzato per la sua capacità di cofloat con vescicole in un gradiente Accudenz in presenza di 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio libero. È mostrato (D) calcio-triggered C2 dominio indotta da liposomi aggregazione come misurato da OD 400. Torbidità di campioni contenenti liposomi è stata monitorata in entrambi 1 mM di calcio libero o 0.1 mM EGTA. Le barre di errore indicano media ± DS (n = 3).
Abbiamo anche sondato per le interazioni tra otoferlin nativo e SNARE complessi ternari.Saggi coimmunoprecipitation usano interi estratti detergenti cervello e GST esperimenti di pull-down con sinaptobrevina ricombinante 2 ha rivelato che otoferlin lega sintaxina ternario 1 / SNAP-25 / sinaptobrevina 2 complessi ma non interagisce direttamente con sinaptobrevina (Fig. S1, A e B), che è analogo a synaptotagmin 1 (Earles et al., 2001).
I domini di C2 legano otoferlin a membrane lipidiche
La capacità di legare otoferlin membrane non è stato affrontato. Poiché synaptotagmin I agisce almeno in parte legandosi a membrane, abbiamo testato ogni otoferlin dominio C2 per l'attività di legame membrana in presenza di EGTA o calcio usando un test liposoma coflotation. In questo saggio, 15%, 55% DOPS POPC, e 30% liposomi PAPA in una soluzione contenente il dominio C2 di interesse sono lanciata attraverso un gradiente di densità, portando con sé qualsiasi proteina legata. SDS-PAGE è eseguita sul campione raccolto per saggiare per proteine legate ai liposomi. A differenza delle suddette misure di fluorescenza, questo test misura direttamente il legame delle proteine di liposomi anziché lo spostamento affinità calcio. Sebbene tutti i sei C2 domini legati a liposomi in presenza di 1 mM di calcio libero (Fig. 4 C), i domini C2A, C2B, e C2C pure tenuti in una certa misura in condizioni prive di calcio. Notiamo anche che i più grandi di tre frammenti C2 dominio dei otoferlin direttamente associati a liposomi in EGTA, e il legame è stato migliorato con l'aggiunta di calcio (Fig. S1 C).
Otoferlin aggrega liposomi in maniera calcio-dipendente
Uno studio precedente di synaptotagmin dimostrato la sua capacità di membrane di aggregati in maniera dipendente dal calcio (Popoli e Paternò 1992), e questa attività è stata proposta per facilitare la fusione delle membrane. Dato il ruolo ipotizzato di otoferlin in esocitosi, abbiamo cercato di determinare se otoferlin can membrane anche aggregati.Aggregazione membrana è stata determinata monitorando i cambiamenti nella OD 400 di liposomi nel tempo (Fig. 4 D). Sebbene l'aggiunta di forme di dominio isolati o multi-C2 di otoferlin ad un campione liposomi in EGTA non ha comportato un aumento sensibile del OD 400 del campione nel corso di 5 min, aggiunta di 1 mM di calcio libero ha comportato una significativa aumento del OD 400 per cinque dei sei domini C2 isolate provati e per le grandi frammenti dominio tre C2 (Fig. 4 D). Questa maggiore valore di OD 400 è rimasto stabile nel periodo di monitoraggio (~15 min) ed è stato invertito per aggiunta di un eccesso di EGTA. Tra i domini C2 testati, solo C2A è riuscito a indurre cambiamenti significativi nel OD 400. L'aggiunta di calcio per soluzioni di liposomi privi di proteine non ha comportato un livello significativo di aggregazione.
Calcio / otoferlin accelera SNARE mediata fusione della membrana
L'utilizzo di un sistema di ricostituita in vitro, gli effetti in vivo di synaptotagmin su SNARE mediata fusione della membrana sono state ricapitolato (Tucker et al., 2004; Bhalla et al., 2006; Stein et al., 2007; Chicka et al, 2008. ; Gaffaney et al., 2008;. Xue et al, 2008). In questo sistema, proteoliposomi v-SNARE contenenti legate alla membrana NBD e di trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza rodamina coppie sono mescolati con t-SNARE proteoliposomi che non contengono fluorofori. Fusione tra V- e t-SNARE proteoliposomi risultati in lipidi miscelazione dei due proteoliposomi e diluizione della coppia trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza. Questa diluizione aumenta la distanza tra il donatore e accettore, conseguente dequenching del NBD. Utilizzando questo sistema, ci siamo chiesti se otoferlin può accelerare SNARE mediata fusione della membrana e se il calcio modula di otoferlin funzione putativa durante la fusione.
In primo luogo abbiamo proiettato i tre-C2 costrutti dominio (C2ABC e C2DEF) per la loro capacità di regolare fusione tra v-SNARE e proteoliposomi t-SNARE (Fig. 5, A e B). I frammenti otoferlin sono stati incubati con un rapporto 1: 2 dei V- e t-SNARE proteoliposomi per 20 min a 37 ° C in 0,1 mM EGTA seguito dall'iniezione di calcio per una concentrazione finale di 1 mM (Fig. 5, A e B, frecce). Dopo aggiunta di calcio, entrambi i frammenti di otoferlin indotto un marcato aumento della velocità e l'entità finale della fusione, come indicato dalla dequenching di NBD fluorescenza. In assenza di calcio, né frammento otoferlin maggiore fusione SNARE-mediata in modo apprezzabile. In assenza di otoferlin, è stato osservato solo un lento aumento lineare SNARE-dipendente in fusione, che è coerente con un precedente studio di ricostituito SNARE mediata fusione della membrana (Chicka et al., 2008). Come controllo finale, e di distinguere tra la fusione completa e hemi, abbiamo bonificato la fluorescenza del foglietto esterno con ditionito e vigilato destino del foglietto interno durante reazioni di fusione ricostituiti. Dopo il trattamento ditionito, è stata osservata dequenching del foglietto interno, dimostrando che completa fusione avvenuta per tutti i costrutti otoferlin riportati in questo studio (dati non pubblicati).
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Figura 5.
Otoferlin stimola SNARE mediata fusione proteoliposome in maniera calcio-dipendente. Esperimenti di fusione sono stati effettuati utilizzando donatori proteoliposomi v-SNARE e t-SNARE proteoliposomi accettore con concentrazioni variabili di frammenti otoferlin ricombinanti. I componenti sono stati incubati per 20 min a 37 ° C in presenza di 0,1 mM EGTA. A t = 20 min, il calcio è stato aggiunto ad una concentrazione finale di 1 mM. (A e B) Sia C2ABC (A) e C2DEF (B) stimolati SNARE mediata fusione proteoliposome in risposta al calcio. (A e B) E indica che l'esperimento è stato condotto in condizioni EGTA. (C e D) Valore medio per l'entità della fusione espressa come percentuale della massima intensità di fluorescenza dopo l'aggiunta di detergente per 10 pM C2ABC (C) e C2DEF (D) nelle condizioni indicate. Fusion è stata attenuata con l'aggiunta di cd-SYB o cd-t-SNARE. Barre di errore rappresentano SD (n = 3).
Titolazione dei frammenti otoferlin ha portato ad un aumento della velocità e il grado di fusione fino a saturazione è stato raggiunto (Fig. 5, A e B), e calcio esperimenti dose-risposta rivelato [Ca 2+] 1/2 valori di 109 pM e 131 micron per C2ABC e C2DEF, rispettivamente (Fig. S2). Per garantire che la fusione proceduto attraverso un percorso SNARE-dipendente, saggi sono stati condotti anche in presenza sia del dominio citoplasmatico solubile synaptobrevin (cd-SYB) o una forma solubile del eterodimero t-SNARE (dominio citoplasmatico del t-SNARE eterodimero [cd-t-SNARE]), che impedirà il corretto trans-SNARE accoppiamento del V- e proteoliposomi t-SNARE. Entrambi cd-SYB e cd-t-SNARE ridotto il grado finale di fusione (Fig. 5, C e D), indicando che otoferlin-accelerato procede fusione attraverso un percorso SNARE-dipendente e che otoferlin sola non può indurre liposomi fusione. Notiamo anche che otoferlin non poteva promuovere la fusione delle membrane dei liposomi che difettavano le proteine V- o t-SNARE (Fig. 5 D).Insieme, questi dati dimostrano per la prima volta che sia la metà N- e C-terminali di otoferlin possono stimolare SNARE mediata fusione delle membrane in modo calcio-promosso.
Abbiamo poi testato se otoferlin può fare "lavoro" sulle proteine SNARE. Un precedente studio ha dimostrato che sintaxina 1 e SNAP-25 deve essere preassemblato prima della ricostituzione di mediare fusione con proteoliposomi v-SNARE (Bhalla et al., 2006).Tuttavia, il calcio e synaptotagmin posso guidare pieghevole di SNAP-25 solubile sul sintaxina ricostituito, con conseguente attività di fusione (Bhalla et al., 2006). Abbiamo ripetuto questi esperimenti e, come mostrato in Fig. 6, apprezzabile la fusione delle membrane non è stata osservata quando sintaxina è stato ricostituito ma SNAP-25 è stata aggiunta in forma solubile. Tuttavia, in presenza di due metà di otoferlin, C2ABC o C2DEF, fusione è stato osservato dopo aggiunta di calcio; in assenza di calcio, la fusione non è stata osservata in qualsiasi condizione (Fig. 6). Questi risultati forniscono la prova funzionale che il calcio / otoferlin regola la piegatura e l'attività delle proteine SNARE.
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Figura 6.
Calcio / otoferlin consente t-SNARE, che non sono stati preassemblati in eterodimeri, a guidare la fusione delle membrane. (A) saggi di Fusion sono stati condotti utilizzando sintaxina ricostituito 1 e sinaptobrevina 2 vescicole in presenza di 15 micron solubile SNAP-25 e 4 micron otoferlin . (B) In entrambi i casi la metà di otoferlin, C2ABC o C2DEF era sufficiente per accelerare la fusione della membrana utilizzando solubile SNAP-25. In assenza di calcio o otoferlin, la fusione non è stata osservata. E indica che l'esperimento è stato eseguito in condizioni EGTA.
Come un sondaggio finale di proprietà funzionali di otoferlin, abbiamo condotto test membrana fusione con domini C2 isolate per determinare quali sono stati responsabili per l'effetto stimolante osservato osservato nei frammenti più grandi (Fig. 7 e Fig. S3). Le concentrazioni di dominio C2 che vanno da 0 a 30 micron è stata titolata nel test di fusione, come dettagliato per le citate frammenti dominio tre C2. Dopo l'aggiunta di calcio at = 20 min, la fusione delle membrane è stata osservata per reazioni che contenevano C2B, C2C, C2D, C2E e C2F per fornire una misura finale di fusione di ~ 20% alle concentrazioni massime testate. È interessante notare, esame della forma delle curve di fusione rivela differenze nella cinetica di fusione, con C2E mostrando più lento rispetto alla cinetica domini isolati C2B, C2C, C2D, e C2F (Fig. 7). Come mostrato in Fig. 7, l'uso di liposomi senza SNARE portato alla totale assenza di fusione per tutte e cinque domini C2, dimostrando ancora il requisito SNARE (Fig. 7). Fino a 30 pM, C2A omesso per accelerare fusione SNARE mediata indipendentemente dalla presenza di calcio (Fig. 7).
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Figura 7.
I domini C2 isolati di otoferlin stimolano la fusione delle membrane. Titolazioni di ogni dominio C2 isolato, 0-30 micron, dimostrare la capacità della domini otoferlin C2 C2B, C2C, C2D, C2E, e C2F per stimolare fusione tra V- e t- proteoliposomi rullante. I domini C2 isolate non sono riusciti a stimolare la membrana fusione tra (PF) liposomi privi di proteine. E indica che l'esperimento è stato eseguito in condizioni EGTA.
Le mutazioni puntiformi disturbare la funzione dei domini C2 di otoferlin
Un isoleucina precedentemente riportato di asparagina mutazione nel dominio C2B di otoferlin è stato trovato per indurre la grave perdita di udito in modelli murini (Longo-Indovina et al., 2007). Sebbene la struttura di questo dominio non è attualmente noto, allineamento di sequenza con altri domini C2 suggerisce che questa mutazione si trova all'interno di uno dei filamenti beta del dominio. Un precedente studio ha suggerito che questa mutazione può interrompere pieghevole, con conseguente diminuzione della stabilità e ha aumentato i tassi di turnover all'interno della cellula (Longo-Indovina et al., 2007). Per studiare le proprietà funzionali di questo mutante, abbiamo introdotto la mutazione I318N nel dominio C2B isolato. Fluorescenza spettri di tipo selvaggio (WT) e il dominio mutante differivano notevolmente (Fig. 8 A), suggerendo una perturbazione della struttura terziaria, e lo spettro di fluorescenza del mutante I318N era influenzata dal calcio(Fig. 8 A), indicando una perdita di attività calcio-sensing. Come una seconda prova di funzionalità, il dominio C2B mutante è stato analizzato per la sua capacità di aggregare membrane; in contrasto con WT, il mutante non ha membrane aggregati in presenza di 1 mM di calcio (Fig. 8 B). Infine, a 30 mM concentrazioni dominio C2 equivalenti, il dominio WT C2B accelerato fusione SNARE-mediata in risposta al calcio aggiunto, mentre il mutante I318N C2B omesso di avere alcun effetto sulla fusione in presenza di EGTA o 1 calcio mM (Fig. 8 C).
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Figura 8.
Un isoleucina patologico di mutazione asparagina missenso distrugge la struttura e la funzione del dominio C2B di otoferlin.(A) Gli spettri di fluorescenza di endogeni residui aromatici del WT isolato (a sinistra) e I318N (a destra) del dominio C2B mutante differiscono nei loro profili spettrali. Sebbene una notevole differenza nell'intensità di fluorescenza (FI) del WT C2B si osserva in 0,1 mM EGTA contro condizioni calcio 1 mM, gli spettri del mutante I318N mostra alcun cambiamento percepibile in fluorescenza in risposta al calcio. (B) L'attività di aggregazione membrana C2B è interrotta dalla mutazione I318N. Dopo l'iniezione di proteine at = -5 min, calcio inserito at = 0 min ad una concentrazione finale di 1 mM. OD 400 misure per la WT C2B (a sinistra) e I318N (a destra) rivelano che la mutazione puntiforme abroga C2B-mediata aggregazione liposomi calcio-triggered. I valori OD 400 dopo aggiunta di calcio erano 0,11 ± 0,02 per WT e 0,02 ± 0,01 per il mutante C2B (n = 3). (C) Prove fusione ricostituiti eseguite in presenza di WT o I318N mutante C2B. Dopo l'aggiunta di 1 mm di calcio gratuito, WT C2B accelerata fusione SNARE-mediata, mentre il I318N non è riuscito a migliorare il tasso o la portata della fusione.
Infine, abbiamo studiato gli effetti di mutanti due dei residui leganti il calcio putativi nel settore C2C di otoferlin (Fig. S4). Queste mutazioni dovrebbero abrogare l'attività legante il calcio del dominio C2 e quindi eliminare la stimolazione calcio-triggered di SNARE mediata fusione della membrana. Infatti, anche se le misurazioni di dicroismo circolare indicano che la proteina mutante è stato correttamente ripiegata (dati non pubblicati), abbiamo trovato che questo mutante non accelera la fusione delle membrane in presenza o assenza di calcio (Fig. S4).
Discussione
L'obiettivo di questo studio è stato quello di verificare se otoferlin è infatti un sensore di calcio in grado di controllare direttamente le reazioni di fusione della membrana SNARE-mediata. Anche se un precedente studio di cellule ciliate interne trovato otoferlin essere essenziale per il rilascio delle vescicole calcio-evocata (Roux et al., 2006), uno studio recente immunofluorescenza non è riuscito a rilevare colocalizzazione tra nastri sinaptiche otoferlin e cellulari capelli, e Schug et al. (2006) suggerivano ruoli alternativi per la proteina, comprese eventuali contributi al Golgi e il traffico endosomale. In questo studio, abbiamo condotto misurazioni dirette utilizzando ridotti negli approcci vitro, tra cui un sistema di fusione della membrana SNARE mediata ricostituito, per testare di otoferlin proprietà funzionali. Questi esperimenti sono vantaggiosi in quanto sono privi di ambiguità che possono sorgere a causa della complessità dei sistemi cellulari e sono quindi in grado di soddisfare direttamente di otoferlin capacità di agire come regolatore calcio-attivato della fusione delle membrane.
Otoferlin rileva concentrazioni micromolari di calcio
Monitorando gli spettri di fluorescenza dei residui aromatici endogeni di otoferlin, abbiamo determinato che almeno cinque dei sei domini C2 del calcio proteine bind con Ca 2+] [1/2valori inferiori a quelli riportati per synaptotagmin I (Davis et al ., 1999; Fernandez et al.,2001;. Nalefski et al, 2001). Solo C2A non si osservava alcun cambiamento della fluorescenza in presenza di calcio. È interessante notare, abbiamo osservato significative variazioni di calcio indotte massimali di emissione per alcuni dei domini C2 e entrambi i frammenti di dominio tre C2. Poiché è stato ben stabilito che gli spettri di emissione di triptofano è altamente sensibile alla polarità del suo ambiente locale (Vivian e Callis 2001), abbiamo il sospetto che i cambiamenti sono causati da variazioni del grado di esposizione del lato aminoacidi aromatici catene a solvente. Infine, titolazioni calcio in presenza di membrane provocato spostato a sinistra [Ca2 +] i valori 1/2 rispetto a campioni mancanti membrane. Pertanto, la presenza di membrane aumenta l'affinità dei domini C2 otoferlin per calcio. Notiamo che le affinità apparenti, misurate in presenza di membrane, sono anche maggiori di quelli precedentemente riportati per synaptotagmin I (Brose et al.,1992;. Davis et al, 1999;. Nalefski et al, 2001).
Tutti i sei domini C2 delle proteine SNARE legano otoferlin
Utilizzando una procedura di immunoprecipitazione, abbiamo scoperto che tutti e sei i domini C2 otoferlin tenuti a syntaxin1A / SNAP-25 eterodimeri. Questa scoperta segna la prima volta tutti i sei settori sono stati analizzati per l'attività-SNARE vincolanti e suggerisce che ognuno di questi domini possono funzionare a modulare l'attività SNARE.È interessante notare che la C2 C-terminale domini C2C, C2D, C2E, e C2F erano più sensibili al calcio in termini di loro proprietà-SNARE vincolante rispetto alla C2A N-terminale e domini C2B. Dato che una variante di splicing contenente solo i tre domini C-terminale è stata riportata, la stechiometria, affinità di legame, e sensibilità al calcio delle otoferlin può essere sintonizzato via preferenziale espressione di forme lunghe o corte della proteina.
Il otoferlin domini C2 legano e membrane lipidiche aggregati
Una caratteristica caratteristica di molti domini C2 riguarda la loro capacità di legarsi a doppi strati lipidici. Inoltre, è stato dimostrato che synaptotagmin I agisce almeno in parte penetrando e piegatura membrane (Martens et al., 2007; Hui et al., 2009). Tuttavia, la questione se otoferlin può legarsi membrane lipidiche non era stato affrontato in uno studio precedente. Usando un test coflotation, abbiamo scoperto che tutti e sei i domini C2 tenuti a liposomi composti da POPC / DOPS / PAPA. Membrana-legame attività è stata promossa da calcio per i domini C2C, C2D, CD2E, e C2F. C2A e C2B hanno mostrato una forte componente di calcio-indipendente vincolante. Sorprendentemente, nonostante la sua capacità di legare membrane in assenza di calcio, calcio C2B ancora necessaria per indurre l'aggregazione dei liposomi, così come C2C, C2D, C2E e C2F. Al contrario, il dominio N-terminale C2A omesso di membrane aggregati in alcuna delle condizioni testate. È interessante notare che, synaptotagmin posso membrane anche aggregare attraverso i suoi domini C2 (Popoli e Paternò, 1992; Bhalla et al., 2006;.Gaffaney et al, 2008). E 'possibile che tutti i domini C2-fusione accelerazione membrana operano in parte attraverso un meccanismo di aggregazione membrana.
Otoferlin stimola SNARE mediata fusione delle membrane in risposta al calcio
Utilizzando un saggio fusione delle membrane ricostituito, abbiamo scoperto che cinque dei sei domini C2 accelerare la fusione delle membrane in presenza di calcio, ma non in condizioni EGTA. Fusion SNARE era dipendente dal fatto che otoferlin riuscito a indurre lipidi miscelazione in presenza di cd-SYB, cd-t-SNARE, o quando liposomi privi di proteine sono stati utilizzati nel saggio di fusione. Questi risultati sono ciò che ci si aspetterebbe da un sensore di calcio per fusione della membrana e qualitativamente sono d'accordo con il lavoro precedente focalizzata sul synaptotagmin I (Tucker et al., 2004;. Chicka et al, 2008;Gaffaney et al., 2008). Tuttavia, otoferlin è distinto da synaptotagmin I in quanto contiene più domini C2-fusione attiva collegati in serie e possiede linker più lunghi tra ciascun dominio C2 che possono dotare otoferlin con flessibilità e raggiungere. Se combinato con i risultati che otoferlin lega miosina VI e canali del calcio (Heidrych et al., 2009;.Ramakrishnan et al, 2009), si è tentati di ipotizzare che i collegamenti di proteine vescicole di insidie e canali del calcio in uno stato ancorato e innescato . Data la nostra scoperta che la maggior parte dei domini C2 di otoferlin possono regolare direttamente la fusione delle membrane e la recente proposta di vescicole sinaptiche legate a nastri sono in grado di fusione composto (Matthews e Sterling, 2008), gli scenari con cui otoferlin potrebbero operare diventare numerosi.
Mutazioni puntiformi disturbare la funzione di domini C2 otoferlin
Mutazioni missense patologici nel C2C (Mirghomizadeh et al., 2002), C2D (Tekin et al., 2005), e domini C2F (Migliosi et al., 2002) di otoferlin sono stati collegati a sordità profonda in diversi pazienti umani. È interessante notare che, in ogni caso, una singola modifica aminoacido in un singolo dominio C2 risultati in sordità; in alcuni casi, questo sembra essere causato dalla degradazione della intera proteina in risposta al misfolding singoli domini. Ad esempio, una mutazione missenso recentemente riportato nel dominio C2B portato alla perdita di otoferlin e sordità nei topi (Longo indovinare et al., 2007).Abbiamo trovato che questa mutazione I318N dato luogo a fluorescenza intrinseca che è stato alterato rispetto al dominio WT C2. I massimi di emissione e l'intensità di spettri di fluorescenza sono altamente sensibili all'ambiente di catene laterali aromatiche della proteina, e il fatto che lo spettro proteina mutante differisce da WT suggerisce alterazione della struttura terziaria del dominio. Inoltre, nessun cambiamento della fluorescenza è stato osservato dopo l'aggiunta di calcio al mutante I318N né era il mutante capace di accelerare SNARE mediata fusione delle membrane in presenza di calcio. Così, l'isoleucina conservati è essenziale per una corretta struttura terziaria, e la sostituzione con un asparagina comporta la perdita di attività del dominio C2B. Come ulteriore controllo, due residui aspartato sono stati sostituiti con alanine nel dominio C2C, e questa proteina mutante non è riuscito a stimolare le reazioni di fusione della membrana SNARE-mediata in risposta al calcio, a conferma della constatazione che i domini C2 da otoferlin sono in buona fede calcio- funzionale I moduli di rilevamento.
In sintesi, abbiamo dimostrato che otoferlin possiede la capacità di legare calcio, membrane, e lacciuoli ed è in grado di accelerare direttamente SNARE mediata fusione delle membrane. Tuttavia, alcune domande relative al otoferlin e la sua funzione devono ancora essere affrontati. Un punto critico riguarda la specificità lipidi legame di ciascun dominio C2. Questa domanda è di particolare interesse perché le specificità dei lipidi di molti domini C2 sono spesso su misura per le loro membrane di destinazione, e quindi, visione questa specificità potrebbe far luce su dove, all'interno delle cellule, le funzioni otoferlin.
Materiali e metodi
Materiali e reagenti
Sintetico DOPS (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfo- L -serine), DOPC (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina), POPC (sn 1-palmitoil-2-oleoyl- -glycero-3-fosfocolina), PAPA (1-palmitoil-2-oleoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina), dansile-PE (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - (5- dimetilammino-1-naphthalenesulfonyl)), NBD-PE (1,2-dipalmitoyl- sn -glycero-3-fosfo-ethanolamine- N - (7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-il)), e rodamina-PE (N - (lissamina rodamina B sulfonyl) -1,2-dipalmitoyl- sn -glycero-3-fosfoetanolamina) sono stati acquistati da Avanti Polar Lipids, Inc. Affinity mezzi Ni 2 + perline ad alte prestazioni -Sepharose sono stati ottenuti da GE Assistenza sanitaria.Accudenz è stato ottenuto da accurata Chemical & Scientific Corporation.
Plasmidi e purificazione della proteina
-cDNA codificante del mouse otoferlin è stato fornito da C. Petit (Istituto Pasteur, Parigi, Francia). Tutti i frammenti sono stati otoferlin subclonati in pTrcHisA o vettori di espressione pGEX (Invitrogen) via BamHI e EcoRI ed espressi in Escherichia coli come proteine di fusione. Purificazione è stata effettuata essenzialmente come descritto in precedenza (Gaffaney et al., 2008). Le mutazioni puntiformi sono stati preparati utilizzando un kit mutagenesi sito-diretta (QuikChange; Agilent Technologies). I plasmidi per il mouse sinaptobrevina 2 e dell'eterodimero t-SNARE (topo SNAP-25B e ratto sintaxina 1A) sono stati forniti da JE Rothman (Yale University, New Haven, CT).Sinaptobrevina 2 e t-SNARE complesso sono stati espressi come precedentemente descritto (Gaffaney et al., 2008).
Liposomi senza proteine e SNARE portanti
Ricostituzione di proteoliposomi SNARE è stata eseguita come precedentemente riportato(Gaffaney et al., 2008). Proteoliposomi sinaptobrevina 2 v-SNARE sono stati costituiti per il 30% in moli PAPA, 52% POPC, il 15% DOPS, 1,5% rodamina-PE (accettore), e il 1,5% NBD-PE (donatore). Sintaxina 1A / SNAP-25B t-SNARE proteoliposomi heterodimer erano composti da 30% in moli PAPA, il 55% in moli POPC, e 15 moli% DOPS. Proteoliposomi conteneva ~100 copie di proteine SNARE per liposomi. Liposomi contenenti proteine sono formate mediante estrusione utilizzando una miscela lipidica equivalente a quella dei proteoliposomi t-SNARE come descritto in precedenza (Hui et al., 2009).
Test di flottazione
Test di flottazione utilizzando liposomi estrusi gratuito di proteine sono state eseguite utilizzando le procedure descritte in precedenza (Bhalla et al., 2006; Gaffaney et al., 2008). Tutte le reazioni otoferlin-liposoma-leganti sono stati eseguiti in entrambi 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio libero in tampone Hepes (Hepes 10 mM e NaCl 100 mM, pH 7,5).15 micron otoferlin è stata incubata con liposomi prima della miscelazione con una media densità Accudenz. La miscela è stata sovrapposta al diminuire quantità di Accudenz (35%, 30% e 0%). Dopo la centrifugazione, i liposomi galleggiavano all'interfaccia 0/30% Accudenz insieme a tutti i frammenti rilegati di otoferlin. Il campione a livello di interfaccia sono state raccolte dall'interfaccia Accudenz, risolta mediante SDS-PAGE, e colorati con Coomassie blu. I gel sono stati ripresi utilizzando uno scanner piano e trattati con Illustrator (Adobe).
Saggi Fusion
Tutti i saggi di fusione sono stati condotti utilizzando un 96 pozzetti lettore di piastre (eccitazione 460-nm ed emissione 538-nm BioTek Instruments, Inc.), come descritto in precedenza con piccole modifiche (Chicka et al., 2008;. Gaffaney et al, 2008) . Fusion campioni contenevano un volume totale di 75 microlitri con 30 microlitri purificati proteoliposomi t-SNARE, 15 microlitri purificati proteoliposomi v-SNARE, 0,1 mM EGTA e 0-30 micron otoferlin proteina in tampone Hepes. Per i campioni in cui è stato aggiunto il calcio, la concentrazione di calcio libero era 1 mM. Al termine di ogni corsa, 0,5% peso / volume n -dodecylmaltoside è stato aggiunto per determinare la massima dequenched segnale di NBD. Fluorescenza Raw è stato normalizzato per ottenere la massima percentuale di fluorescenza come descritto in precedenza (Chicka et al., 2008; Gaffaney et al., 2008).
Misure proteina fluorescente
Misure di fluorescenza di residui nativi aromatici in vari frammenti otoferlin sono state eseguite utilizzando un fluorimetro (QM-1; Photon International Technology) in tampone Hepes più 0,1 mM EGTA utilizzando liposomi con una composizione lipidica equivalente a quella dei liposomi t-SNARE. Per le titolazioni calcio esperimenti, è stata utilizzata una soluzione madre Hepes tamponata di cloruro di calcio, e la concentrazione di calcio libero è stato determinato usando WebMaxC (www.stanford.edu/~cpatton/webmaxcS.htm).
Test Immunoprecipitazione
Esperimenti di immunoprecipitazione sono stati eseguiti come precedentemente descritto(Hui et al., 2009) con modifiche. 10 mM t-SNARE eterodimero è stato incubato con 20 pM otoferlin dominio C2 in tampone Hepes più 0,5% Triton X-100 per 1 h in ghiaccio in presenza di 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio. t-SNARE sono stati precipitati con l'aggiunta di 3 ml di un anticorpo monoclonale diretto contro syntaxin (HPC-1) che è stato fornito da R. Jahn (Max-Planck-Institut, Gottinga), seguita dall'aggiunta di 40 microlitri proteine G- Sepharose Fast Flow tallone liquami (GE Healthcare). Dopo 1 h, perle sono state raccolte per centrifugazione e lavate quattro volte. Le proteine di ogni campione sono state risolte mediante SDS-PAGE e visibili con la colorazione Coomassie blu. I gel sono state digitalizzate con uno scanner e trattati con Illustrator.
Intere lisato cervello immunoprecipitazione sono stati effettuati utilizzando estratti detergenti cervello di ratto che sono stati preparati come descritto in precedenza(Chapman et al., 1995; Lewis et al., 2001). 1% Triton X-100 è stato utilizzato per la solubilizzazione. Esperimenti di immunoprecipitazione sono state eseguite come descritto in precedenza (Bai et al., 2004). Per syntaxin 1A immunoprecipitazione, è stato utilizzato l'anticorpo HPC-1. Immunoblots successivi a fronte di otoferlin usato un anti-otoferlin monoclonale fornito da S. Safieddine (Université Pierre et Marie Curie, Parigi, Francia).Per immunoprecipitazione otoferlin, un anticorpo anti-otoferlin ottenuto da Abcam stata utilizzata seguita da immunoblotting con l'anticorpo HPC-1 per rilevare syntaxin 1A.Pellicola Chemiluminescenza (Research Products International Corp.) è stato utilizzato per visualizzare le macchie. Macchie sono state digitalizzate con uno scanner da tavolo e trattati con Illustrator.
Misure di torbidità
Esperimenti di aggregazione di membrana sono state fatte attraverso il monitoraggio OD400 valori utilizzando uno spettrofotometro UV-visibile (BioSpec-1601; Shimadzu Corporation). 500 campioni contenevano microlitri liposomi (lipidi di 1 mm) composto da 55% POPC / 15% / 30% DOPS PAPA più il indicata otoferlin frammento Hepes buffer e 100 micron EGTA; calcio viene aggiunto ad una concentrazione finale di 1 mM, come indicato in fig. 1 - 8.
Saggi pull-down
Saggi GST-pull down sono state eseguite come descritto in precedenza con 80 mcg bead-immobilizzata GST-C2ABC o GST-C2DEF (Lewis et al., 2001; Dong et al., 2003). In breve, i complessi SNARE sono formate incubando 50 micron t-SNARE eterodimero e 50 micron sinaptobrevina 2 notte a 4 ° C. I complessi SNARE sono stati incubati con GST-otoferlin in tampone legante composto Hepes 10 mM, NaCl 100 mM, 0,5% Triton X-100, e lo 0,1 mM EGTA o 1 mM di calcio. Dopo 1 h, le perle sono state lavate tre volte con tampone di legame, e il campione è stato trattato con tampone campione SDS, sottoposti a SDS-PAGE e visualizzati tramite immunoblotting. Per blotting, è stato utilizzato l'anticorpo anti-sintaxina HPC-1. Pellicola Chemiluminescenza è stato utilizzato per visualizzare le macchie. Macchie sono state digitalizzate con uno scanner da tavolo e trattati con Illustrator.
Materiale supplementare online
Fico. S1 mostra che otoferlin lega SNARE complessi ternari ma non si lega ai isolata sinaptobrevina 2. fig. S2 mostra calcio dose-risposta per otoferlin regolamentati SNARE mediata fusione delle membrane. Fico. S3 dimostra quantificazione di 30 micron otoferlin C2 dominio stimolata SNARE mediata fusione delle membrane. Fico. S4 mostra che la neutralizzazione del calcio putative ligandi D515 e 517 nel dominio del C2C otoferlin abolisce fusione calcio-stimolata. Materiale supplementare online è disponibile ahttp://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.201002089/DC1.
Ringraziamenti
Ringraziamo M. Beurg e R. Fettiplace per discussioni costruttive.
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (concedere MH 61876).ER Chapman è un Investigator del Howard Hughes Medical Institute.
Note
- Abbreviazioni utilizzate in questo documento:
cd-SYB
dominio citoplasmatico di sinaptobrevina
cd-t-SNARE
dominio citoplasmatico dell'eterodimero t-SNARE
IHC
cellule ciliate interne
WT
tipo selvaggio
- Inviato: 16 febbraio, 2010
- Accettato: 7 Settembre 2010
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APPROFONDIMENTO
Sordità OTOF-correlate
Sinonimi: DFNB9, DFNB9 non sindromica perdita dell'udito
Richard JH Smith, MD, Jose G Gurrola, II, MD, e Philip M. Kelley, PhD.
Pubblicazione iniziale: 29 febbraio 2008; Ultima revisione: 14 Giugno 2011.
Riassunto
. Caratteristiche della malattia di sordità OTOF connesse (DFNB9 perdita di udito non sindromica) è caratterizzato da due fenotipi: perdita prelinguale non sindromica udito e, meno frequentemente, non sindromica neuropatia uditiva sensibile alla temperatura (TS-NSAN). La perdita di udito non sindromica è bilaterale grave a profonda congenita sordità. Nei primi uno o due anni di vita, sordità OTOF legati può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test elettrofisiologico in cui le risposte del tronco cerebrale uditivo (ABR) sono assenti e le emissioni otoacustiche (OAEs) sono presenti. Tuttavia, con il tempo OAE scompaiono e test elettrofisiologico è più coerente con un difetto cocleare. La distinzione tra neuropatia uditiva e un difetto cocleare è importante in quanto gli impianti cocleari possono essere di valore marginale in persone con neuropatia uditiva. TS-NSAN caratterizzata da perdita di udito normale a lieve in assenza di febbre e perdita dell'udito significativa vanno da grave a profonda in presenza di febbre. Quando la febbre si risolve, sentendo ritorna normale.
Diagnosi / testing. La diagnosi di sordità OTOF legati si sospetta basata su dati clinici, inclusi i risultati delle ABR se nelle fasi iniziali. La diagnosi è confermata dal test di genetica molecolare di OTOF, il genecodificante la proteina otoferlin. OTOF è l'unico gene noto per essere associate a questa condizione.
Gestione Trattamento delle manifestazioni:. Nei soggetti con non sindromica bilaterale congenita perdita di udito, apparecchi acustici nel più breve tempo possibile, la considerazione di impianti cocleari, e programmi educativi progettati per le persone con danni all'udito.
Prevenzione delle manifestazioni primarie: Per gli individui con TS-NSAN, prevenire febbri e le altre attività / condizioni ambientali che potrebbero causare la temperatura corporea a salire.
Sorveglianza: Nei soggetti con non sindromica bilaterale congenita perdita di udito, esame annuale / semestrale da un medico familiarità con insufficienza uditiva ereditaria, ripetere audiometria inizialmente ogni 3-6 mesi per determinare se la perdita dell'udito è progressiva.
Valutazione dei parenti a rischio: Valutazione di fratelli e sorelle più presto possibile dopo la nascita per la perdita dell'udito; se sono note le mutazioni che causano sordità in famiglia, test di genetica molecolare di fratelli e sorelle poco dopo la nascita in modo che un adeguato supporto e la gestione precoce può essere fornita al bambino e alla famiglia.
La consulenza genetica. OTOF legati sordità è ereditata come autosomica recessiva modo. Al momento del concepimento, ogni sib di un individuo con sordità OTOF legate ha una probabilità del 25% di avere sordità OTOF-correlati, una probabilità del 50% di essere un elemento portante , e una probabilità del 25% di essere inalterato e non un vettore. Gli eterozigoti (portatori) sono asintomatici. Test di vettore per a rischio parenti e test prenatale per gravidanze a rischio aumentato sono possibili se si conoscono le mutazioni che causano sordità in una famiglia.
Diagnosi
Diagnosi clinica
Sordità OTOF connesse (perdita di udito non sindromica al DFNB9 locus ) è caratterizzata da bilaterale grave da profonda congenita sordità.
Nei primi uno o due anni di vita, sordità OTOF legati può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test elettrofisiologico in cui le risposte del tronco cerebrale uditivo (ABR) sono assenti e le emissioni otoacustiche (OAEs) sono presenti. Tuttavia, con il tempo OAE scompaiono e test elettrofisiologico diventa più coerente con un difetto cocleare.
Molecular Genetic Testing
Gene. OTOF legati sordità è causata da mutazioni in OTOF, che codifica per la proteina otoferlin.
Sperimentazione clinica
· L'analisi di sequenza di OTOF. La mutazione frequenza di rilevamento per l'analisi di sequenza si avvicina al 99%.
· Multi- gene pannelli. Sebbene test singolo gene per OTOF viene eseguita in un numero di laboratori, in test genetici generale dell'udito è avanzata verso metodi di analisi multi-gene in cui nuovi metodi di DNA analisi possono essere utilizzate per l'analisi simultanea di numerosi geni associati alla perdita dell'udito ereditaria [ Shearer et al 2010 ]. Questi pannelli variano da metodi utilizzati ed i geni inclusi; quindi, la capacità di un pannello per rilevare un causativo mutazione o mutazioni in un dato individuo varia.
Tabella 1. Summary of Molecular Genetic Testing Utilizzato in Sordità OTOF-correlate
|
Gene Symbol |
Metodo di prova |
Mutazioni identificate |
L'identificazione della mutazione frequenza con il metodo di prova 1 |
|
OTOF |
L'analisi di sequenza |
Varianti di sequenza 2 |
99% |
1. La capacità del metodo di prova utilizzato per rilevare una mutazione che è presente nel indicata gene
2. Esempi di mutazioni identificate da analisi di sequenza possono includere piccole delezioni intrageniche / inserimenti e missense, nonsense, e sito di splice mutazioni.
Interpretazione dei risultati del test. Per le questioni da considerare nell'interpretazione di analisi di sequenza dei risultati, fare clic qui .
Strategia di sperimentazione
Per confermare / stabilire la diagnosi di un probando . In un bambino con grave a profonda bilateralecongenita sordità in cui la storia clinica e un esame fisico sono coerenti con la diagnosi di autosomica recessivaperdita di udito non sindromica, le seguenti strategie di sperimentazione si basano su genetica molecolare test :
· Sequential test di genetica molecolare di singoli geni:
o Prima eseguire test di genetica molecolare di GJB2 (vedi non sindromica Perdita dell'udito e sordità, DFNB1 ); se solo un GJB2 mutazione viene rilevato, effettuare la cancellazione / analisi di GJB6
o Se il test di genetica molecolare per mutazioni nella DFNB1 locus (mutazioni intragenicheGJB2 e delezioni GJB6) non identifica due mutazioni che causano sordità, eseguire TC o RMN delle ossa temporali per valutare la dilatazione dell'acquedotto vestibolare (DVA) e Mondini displasia:
§ La presenza di uno di questi dell'osso temporale anomalie warrant test di genetica molecolare di SLC26A4. (Vedere Pendred Syndrome/DFNB4 .)
§ Se queste anomalie delle ossa temporali non sono presenti, test di genetica molecolare dovrebbe essere considerato di OTOF.
E / O
· Utilizzo di un pannello multigene che analizza simultaneamente più geni associati con perdita uditiva ereditaria
Poiché i test elettrofisiologico eseguito su un bambino con sordità OTOF legati durante il primo anno o due di vita può essere coerente con neuropatia uditiva, OTOF test di genetica molecolare è garantito in tutti i bambini con congenita neuropatia uditiva senza una storia di fattori ambientali causali (ad esempio, iperbilirubinemia neonatale e ipossia neonatale). Tuttavia, l'assenza di evidenza elettrofisiologica di neuropatia uditiva non esclude la sordità OTOF legate perché con il tempo OAE scompaiono e risultati dei test elettrofisiologico diventano più coerente con un difetto cocleare.
Test di vettore per a rischio parenti richiede la preventiva identificazione delle mutazioni che causano sordità in famiglia.
Nota: I vettori sono eterozigoti per questa autosomica recessiva condizioni e non sono a rischio di sviluppare la malattia.
La diagnosi prenatale per gravidanze a rischio richiede la preventiva identificazione delle mutazioni che causano sordità in famiglia.
Geneticamente correlati (alleliche) Disturbi
Perdita di udito non sindromica è l'unico fenotipo note per essere associate con mutazioni in OTOF.
Descrizione clinica
Storia Naturale
I due fenotipi osservati nei sordità OTOF connesse sono la perdita di udito non sindromica prelinguale e, meno frequentemente, non sindromica neuropatia uditiva sensibile alla temperatura (TS-NSAN).
Perdita di udito non sindromica OTOF legata è caratterizzato da prelinguale, sordità in genere gravi a profonde, senza anomalie dell'orecchio interno su RM o TAC esame delle ossa temporali. Grave sordità è definita come la perdita di 71-90 dB dell'udito; sordità profonda è una perdita uditiva superiore a 90 dB.
TS-NSAN presenta tipicamente con la perdita normale-to-mite udienza quando l'individuo è afebbrili. Con la comparsa di febbre, persone con TS-NSAN hanno una significativa perdita di udito vanno da grave a profonda; udito torna alla normalità quando la febbre è stato risolto. Discriminazione vocale è stata descritta come normale diminuita leggermente al basale con un significativo peggioramento durante i periodi febbrili.
Genotipo-fenotipo Correlazioni
Solo limitato genotipo - fenotipo correlazioni sono state fatte, coinvolgendo principalmente i rapporti di temperatura-sensibili non sindromica neuropatia uditiva (TS-NSAN).
· Un missense allele , c.1544T> C (p.Ile515Thr) , è stato trovato in stato di eterozigote in un individuo che è stato osservato per avere TS-NSAN [ Varga et al 2006 ].
· Una delezione , c.5410_5412delGAG (p.Glu1804del) , è stato segnalato per essere omozigote in tre membri di una famiglia con simili TS-NSAN [ Marlin et al 2010 ].
· Un individuo è stato trovato per avere c.2975_2976delAG (p.Gln994Valfs * 7) e c.4819C> T (p.Arg1607Trp) mutazioni in OTOF su iter per il TS-NSAN [ Wang et al 2006 ].
Nomenclatura
La diversa gene loci per la sordità non sindromica sono designati DFN (per d bis fn ess).
Loci sono denominati in base a modalità di trasmissione :
· DFNA: autosomica dominante
· DFNB: autosomica recessiva
· DFN: X-linked
Il numero che segue le designazioni di cui sopra riflette l'ordine del gene mappatura e / o la scoperta.
Prevalenza
La prevalenza mondiale di mutazioni OTOF nelle persone con grave a profonda congenita autosomica recessiva sordità sindromica rimane sconosciuto.
· Studi in popolazioni spagnole suggeriscono che OTOF può essere responsabile per il 5% -8% dei prelinguale autosomica recessiva perdita di udito [ Rodríguez-Ballesteros et al 2008 ].
· Uno studio nella popolazione pakistana suggerisce che la frequenza di alleli mutanti è circa 2,3% in persone con recessiva congenita / prelinguale insorgenza da grave a profonda sordità [ Choi et al 2009 ].
Diagnosi differenziale
Congenita (o prelinguale) ereditata ipoacusia colpisce circa uno su 1.000 neonati. Trenta per cento di questi bambini hanno anomalie aggiuntive, rendendo la diagnosi di una forma sindromica di ipoacusia possibile (vedere ereditaria Sordità e perdita dell'udito panoramica ). Nei paesi sviluppati, circa la metà dei restanti figli (cioè il 70% con problemi di udito non sindromica) segregare mutazioni in GJB2 [ Smith et al 2005 ].
Le mutazioni in 28 geni (tra cui OTOF) sono stati implicati in congenita autosomica recessiva sordità sindromica. La prevalenza delle mutazioni OTOF nella popolazione congenitamente sordi è nota; mutazioniOTOF può essere una causa comune di isolato neuropatia uditiva durante i primi uno o due anni di vita.Tuttavia, è importante notare che con il tempo OAE scompare ei risultati dei test elettrofisiologico sono più coerenti con un difetto cocleare.
Altre neuropatie ereditarie non sindromiche uditive sono i seguenti:
· DFNB59, autosomica recessiva neuropatia uditiva causata da mutazioni nel PJVK, il gene che codifica la proteina pejvakin [ Delmaghani et al 2006 , Schwander et al 2007 ]
· Autosomica dominante neuropatia uditiva associato al AUNA1 locus ( cromosoma 13q14-q21) [Kim et al 2004 ]
Mutazioni OTOF sono estremamente improbabile in un bambino con ipoacusia grave-to-profonda in un solo orecchio e le risposte elettrofisiologiche coerente con neuropatia uditiva. Invece, un difetto cocleare deve essere considerato; RM è indicata [ Buchman et al 2006 ].
Nota per i medici: per
un paziente-specifico 'simultaneo consultare' legate a questa condizione,
andare a 
,
Un sistema diagnostico strumento interattivo decisione supporto software che
fornisce diagnosi differenziali basate sui risultati dei pazienti
(registrazione o di accesso istituzionale necessario).
Gestione
Valutazioni dopo la diagnosi iniziale
Per stabilire la misura del coinvolgimento in un individuo con diagnosi di sordità OTOF-correlati, le seguenti valutazioni sono raccomandati (cfr. Hereditary Deafness and Hearing Loss Panoramica ):
· Valutazione della acuità uditiva (prove di emissione ABR, audiometria tonale)
· Thin-cut CT delle ossa temporali per individuare anomalie strutturali
Trattamento delle manifestazioni
Vedere ereditaria Sordità e perdita dell'udito Panoramica per i dettagli.
Audizione abilitazione per quelli con non sindromica bilaterale congenita perdita dell'udito
· Gli apparecchi acustici devono essere montati il più presto possibile.
·
L'impianto cocleare (CI) deve essere considerato. CI è stato
realizzato con successo in due bambini con sordità OTOF legati
[ Rouillon
et al 2006 ].
Nota: Nei primi uno o due anni di vita, sordità OTOF legati
può sembrare di essere una neuropatia uditiva basata su test
elettrofisiologico; Tuttavia, con il tempo di test elettrofisiologico
diventa più consistente con un difetto cocleare. Distinguere tra una
neuropatia uditiva e un difetto cocleare è importante in quanto gli impianti
cocleari possono essere di valore marginale nei soggetti con neuropatia uditiva
come quello osservato nella sordità-distonia
ottica neuronopathy (ddon) [Brookes
et al 2008 ].
I programmi educativi progettati per le persone con ipoacusia sono appropriati.
Prevenzione delle manifestazioni primarie
Per gli individui con TS-NSAN:
· Prevenire episodi febbrili.
· Evitare il livello di esercizio e / o condizioni ambientali che potrebbero causare la temperatura corporea a salire.
· Trattamento di episodi febbrili più rapidamente possibile ritornare alla normale temperatura corporea.
· Fai pazienti e operatori sanitari consapevoli del fatto che l'insorgenza di perdita dell'udito può essere il primo segno di un evento pyretic / infettiva che richiede un trattamento [ Starr et al 1998 ].Occorre incoraggiare le opportune precauzioni, tra cui evitare situazioni potenzialmente pericolose o rumorosi.
Sorveglianza
Gli individui con non sindromica bilaterale congenita perdita di udito:
· Esaminare semestralmente o annualmente da un medico familiarità con insufficienza uditiva ereditaria.
· Ripetere audiometria inizialmente ogni 3-6 mesi per determinare se la perdita dell'udito è progressiva.
Agenti / Circostanze da evitare
Gli individui con TS-NSAN. Evitare e / o curare le temperature corporee eccessive quando possibile. Studi di follow-up non hanno dimostrato il successo delle misure preventive come un efficace trattamento a lungo termine in questa popolazione di pazienti. Continua la valutazione e il follow-up dovrebbe essere incoraggiata.
Valutazione dei parenti a rischio
A rischio i parenti dovrebbero essere valutati per la perdita e la neuropatia uditiva (che può essere presente durante l'infanzia) dell'udito.
Se si conoscono le mutazioni specifiche per famiglie, test di genetica molecolare di fratelli e sorelle è opportuno subito dopo la nascita in modo che il sostegno e la gestione adeguata e precoce possono essere forniti per il bambino e la famiglia.
Vedere la consulenza genetica per le questioni relative alle prove di a rischio parenti per consulenza geneticascopi.
Terapie sotto inchiesta
Cerca ClinicalTrials.gov per l'accesso alle informazioni sugli studi clinici per una vasta gamma di malattie e condizioni. Nota: Non ci può essere studi clinici per questa condizione.
La consulenza genetica
La consulenza genetica è il processo di fornire individui e famiglie, con informazioni sulla natura, eredità, e le implicazioni di malattie genetiche per aiutarli a prendere decisioni personali e mediche informate. La sezione seguente si occupa di valutazione del rischio genetico e l'uso della storia della famiglia e il test genetico per chiarire lo status genetico per i familiari. Questa sezione non è destinata ad affrontare tutte le questioni personali, culturali o etici che gli individui possono affrontare o per sostituire la consultazione con una genetica professionali. -ED.
Modalità di ereditarietà
Sordità OTOF relativi viene ereditata in un autosomica recessiva modo.
Rischio per i membri della famiglia
I genitori di un probando
· I genitori di un bambino con sordità OTOF connesse sono eterozigoti obbligati e quindi portano uno-sordità causa allele .
· Gli eterozigoti (portatori) sono asintomatici.
Fratelli e sorelle di un probando
· Al momento del concepimento, ogni sib di un individuo con sordità OTOF legate ha una probabilità del 25% di essere sordo, una probabilità del 50% di essere un elemento portante , e una probabilità del 25% di essere inalterato e non un vettore.
· Una volta che un sib a rischio è noto per essere udito, la probabilità della sua / il suo essere unelemento portante è di 2/3.
· Gli eterozigoti (portatori) sono asintomatici.
Offspring of a proband . The offspring of an individual with OTOF -related deafness are obligate heterozygotes (carriers) for a deafness-causing mutation in OTOF .
Other family members of a proband . For each sib of the proband's parents, the probability of being acarrier is 50%.
Rilevamento Carrier
Carrier testing for at-risk family members is possible if the deafness-causing mutations have been identified in the family.
Genetica correlati Counseling Problemi
See Management, Evaluation of Relatives at Risk for information on testing at-risk relatives for the purpose of early diagnosis and treatment.
Family planning
· The optimal time for determination of genetic risk, clarification of carrier status, and discussion of the availability of prenatal testing is before pregnancy.
· It is appropriate to offer genetic counseling (including discussion of potential risks to offspring and reproductive options) to young adults who are affected , are carriers, or are at risk of being carriers.
The following points are noteworthy:
· Communication with individuals who are deaf requires the services of a skilled interpreter.
· Deaf persons may view deafness as a distinguishing characteristic and not as a handicap, impairment, or medical condition requiring a "treatment" or "cure," or to be "prevented." In fact, having a child with deafness may be preferred over having a child with normal hearing.
· Many deaf people are interested in obtaining information about the cause of their own deafness, including information on medical, educational, and social services, rather than information about prevention, reproduction, or family planning. As in all genetic counseling , it is important for the counselor to identify, acknowledge, and respect the individual's/family's questions, concerns, and fears.
· The use of certain terms is preferred: probability or chance vs risk; deaf and hard-of-hearing vs hearing impaired. Terms such as " affected ," "abnormal," and "disease-causing" should be avoided.
DNA banking is the storage of DNA (typically extracted from white blood cells) for possible future use. Because it is likely that testing methodology and our understanding of genes, mutations, and diseases will improve in the future, consideration should be given to banking DNA of individuals who are deaf or hard of hearing.
Test prenatale
Prenatal diagnosis for pregnancies at increased risk is possible by analysis of DNA extracted from fetal cells obtained by amniocentesis usually performed at approximately 15 to 18 weeks' gestation or chorionic villus sampling (CVS) at approximately ten to 12 weeks' gestation. Both deafness-causing alleles must be identified before prenatal testing can be performed.
Nota: l'età gestazionale è espresso in settimane mestruali calcolati sia dal primo giorno dell'ultimo periodo mestruale normale o da misure ad ultrasuoni.
Requests for prenatal testing for conditions which (like OTOF -related deafness) do not affect intellect or life span are not common. Possono esistere differenze di prospettiva tra i professionisti medici e all'interno delle famiglie riguardo l'uso di test prenatale, in particolare se il test viene considerato ai fini della interruzione della gravidanza, piuttosto che la diagnosi precoce. Although decisions regarding prenatal testing are the choice of the parents, discussion of these issues is appropriate.
Preimplantation genetic diagnosis (PGD) may be an option for some families in which the deafness-causing mutations have been identified.
Risorse
GeneReviews staff has selected the following disease-specific and/or umbrella support organizations and/or registries for the benefit of individuals with this disorder and their families. GeneReviews is not responsible for the information provided by other organizations. For information on selection criteria, click here .
· Alexander Graham Bell Association for the Deaf and Hard of Hearing
3417 Volta Place Northwest
Washington DC 20007
Phone: 866-337-5220 (toll-free); 202-337-5220; 202-337-5221 (TTY)
Fax: 202-337-8314
Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.
· American Society for Deaf Children (ASDC)
800 Florida Avenue Northeast
# 2047
Washington DC 20002-3695
Phone: 800-942-2732 (Toll-free Parent Hotline); 866-895-4206 (toll free voice/TTY)
Fax: 410-795-0965
Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.; Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.
· my baby's hearing
This site, developed with support from the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, provides information about newborn hearing screening and hearing loss.
· National Association of the Deaf (NAD)
8630 Fenton Street
Suite 820
Silver Spring MD 20910
Phone: 301-587-1788; 301-587-1789 (TTY)
Fax: 301-587-1791
Email: Questo indirizzo email è protetto dagli spambots. È necessario abilitare JavaScript per vederlo.
· National Library of Medicine Genetics Home Reference
· NCBI Genes and Disease
Genetica molecolare
Information in the Molecular Genetics and OMIM tables may differ from that elsewhere in the GeneReview: tables may contain more recent information. — ED.
Table A. OTOF-Related Deafness: Genes and Databases
|
Locus Nome |
Gene Symbol |
Cromosomica Locus |
Proteine Nome |
Locus Specific |
HGMD |
|
DFNB9 |
Sordità
Gene Mutation Database (OTOF) |
I dati sono compilati dai seguenti riferimenti standard: Simbolo gene da HGNC ; cromosomico luogo, nome luogo, regione critica, complementazione gruppo da OMIM ; Nome proteine UniProt . Per una descrizione di basi di dati (Locus Specific, HGMD) per cui sono previsti collegamenti, fare clic qui .
Tabella B. OMIM Inserzioni per Sordità OTOF-correlati ( Visualizza tutto in OMIM )
|
SORDITA ', AUTOSOMICA RECESSIVA 9; DFNB9 |
|
|
Otoferlin; OTOF |
Molecular Genetic Patogenesi
Otoferlin appartiene ad una piccola famiglia di proteine citosoliche membrana ancorata che include dysferlin (codificata dal DYSF), myoferlin (codificata dal MYOF), e un quarto membro predetto FER1L4 (codificata dal FER1L4). I geni Ferlin sono così chiamati a causa della loro somiglianza strutturale di un gene trovato inC. elegans, fer-1, che è richiesto per la normale maturazione degli spermatozoi.
Con l'eccezione di OTOF, perdita dell'udito non è stato associato con i membri di questo gene famiglia DYSFè associato con tre diversi tipi di miopatie distali:. Miyoshi miopatia (MM), arti-distrofia muscolare dei cingoli di tipo 2B (LGMD2B), e miopatia distale con tibiale anteriore esordio (DMAT) [ Bashir et al 1998 , Liu et al 1998 , Weiler et al 1999 ] (vedere Dysferlinopathy ). Myoferlin, che è codificata dal FER1L3, è necessaria per la normale fusione dei mioblasti [ Doherty et al 2005 ]. La funzione di FER1L4 non è nota ( Figura 1 ).
Figura 1. Protein organizzazione motivi per la famiglia Ferlin
gene umano come determinato da SMART [Schultz et al 1998, Letunic et al
2002]
C2 (verde) è il motivo legante il calcio.
CC (giallo) è un dominio coiled-coil.
TM (blu) è (continua. ..)
Nel topo, otoferlin è espresso in cocleare, vestibolare, e tessuto cerebrale [ Yasunaga et al 1999 ]. Cervello di topo e coclea hanno distinte isoforme che differiscono principalmente nella inclusione di esoni 6 e 47. La conseguenza di inclusione di questi esone è una sequenza proteica distinta C-terminale. Fatta eccezione per l'assenza di un breve isoforma topo, isoforma espressione tessuto-specifica è concorde tra topo e umana [Yasunaga et al 2000 ]. Nella coclea, otoferlin si crede di svolgere un ruolo nella esocitosi delle vescicole sinaptiche al nastro sinapsi uditivo delle cellule ciliate interne [ Roux et al 2006 ].
Varianti alleliche normali. OTOF costituito da 48 esoni codificanti che si estendono oltre 100 kb di genomica DNA . Le brevi isoforme hanno solo tre domini C2. Un certo numero di varianti alleliche non patogeni sono stati descritti (vedi Tabella 3 ).
Varianti alleliche patologiche. Le 24 mutazioni patologiche che sono stati riportati in OTOF (vedi Tabella 4) sono distribuiti in tutto il gene . La maggior parte sono previsti da mutazioni inattivanti e sono associati con sordità grave a profonda [ Yasunaga et al 1999 , Adato et al 2000 , Yasunaga et al 2000 , Houseman et al 2001 , Migliosi et al 2002 , Mirghomizadeh et al 2002 , Rodríguez- Ballesteros et al 2003 , Varga et al 2003, Hutchin et al 2005 , Tekin et al 2005 , Rouillon et al 2006 , Varga et al 2006 ]. No mutations have been reported to be more frequent in specific ethnic groups with the exception of c.2485C>T (p.Gln829*), which is present in 3%-5% of the Spanish population with severe-to-profound nonsyndromic, prelingual deafness [Migliosi et al 2002 , Rodríguez-Ballesteros et al 2003 ] ( Figure 2 ).
Figure 2. Schematic of OTOF on chromosome 2p23. The OTOF genomic structure comprises 48 exons that are used to transcribe the long isoform (NM_194248.1; NP_919224.1). The short isoform does not include the first 19 exons, which are shown as blue bars. (more...)
Table 2. Selected OTOF Pathologic Allelic Variants
|
DNA Nucleotide
Change |
Proteina Amino
Acid Change |
Riferimenti |
Sequenze di riferimento |
|
c.1544T>C |
p.Ile515Thr |
||
|
c.2485C>T |
p.Gln829 * |
||
|
c.2975_2976delAG |
p.Gln994Valfs
* 7 |
||
|
c.4819C> T |
p.Arg1607Trp |
||
|
c.5410_5412delGAG |
p.Glu1804del |
Nota sulla classificazione variante:. Varianti elencati nella tabella sono stati forniti dall'autore (s) PersonaleGeneReviews non sono verificate in modo indipendente la classificazione delle varianti.
Nota sulla nomenclatura: GeneReviews segue le convenzioni di denominazione standard della Human Genome Variation Society ( www . Hgvs.org ). Vedere Riferimento rapido per una spiegazione di nomenclatura.
1. Designazione Variant che non è conforme alle convenzioni di denominazione corrente
Normali prodotti genici . splicing alternativo trascrizioni combinato con l'uso di diversi differenti traduzioneiniziazione siti comportare più corte e lunghe isoforme della proteina [ Yasunaga et al 1999 , Yasunaga et al 2000 ]. I primi 19 esoni sono unici per le lunghe isoforme, che contengono sei moduli strutturali leganti il calcio chiamate domini C2 essenziali per la fusione delle vescicole membrana, un dominio coiled-coil, e un dominio transmembrana. Le lunghe isoforme di otoferlin hanno 1997 amminoacidi con sei C2 domini, un dominio coiled-coil, e un dominio transmembrana, e portano omologia con la proteina sinaptica vescicola synaptotagamin. I domini C2 legano i fosfolipidi in presenza di calcio e sono implicati nella fusione delle membrane. Roux et al [2006] ipotizzare che otoferlin è richiesto per l'alto tasso di fusione delle vescicole sinaptiche nelle cellule ciliate interne.
Anormale prodotto genico . Diciassette delle note 24 mutazioni patologiche sono mutazioni inattivanti che portano alla grossolanamente proteina anormale o, in caso di nonsense-mediata mRNA decay, nessuna proteina affatto. Molte persone con sordità OTOF connesse sono due mutazioni inattivanti, suggerendo che la sordità profonda associata a questo genotipo riflette la totale assenza di otoferlin. Nelle persone che sono eterozigoti composti per due mutazioni missense, o un inattivante mutazione e una mutazione missense , la mutazione missense è previsto un funzionamento difettoso. Sia disfunzione (a) altera i tempi di fusione della vescicola sinaptica, determinando così una perdita di codifica temporale (dissincronia uditiva), o (b) si accumula nelle vescicole perturbano trasporto nelle cellule ciliate interne non è noto. E 'possibile che le differenze funzionali possono essere associati con differenze fenotipiche riflesse dalle differenze di acuità uditiva, anche se sono necessari ulteriori studi per stabilire se eventuali fenotipo esistono correlazioni genotipo-in associazione con proteine otoferlin anormale.
Riferimenti
Letteratura citata
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Cronologia delle revisioni
· 14 giugno 2011 (cd) Revisione: Link a sentire gli annunci del pannello di perdita / sordità in GeneTests Laboratory Directory disponibile
· 26 aprile 2011 (me) l'aggiornamento completo pubblicato dal vivo
· 29 febbraio 2008 (me) recensione scritta a vivere sito web
· 15 ottobre 2007 (rjhs) presentazione originale
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ID Bookshelf: NBK1251 PMID: 20301429
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